Direkte Starten eines Replication Fork von einem Head-On RNA Polymerase Stalled

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Schicksal der Repli-Zone und der RNA-Polymerase oder RNAP nach einer frontal erfolgenden Kollision zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst der Transkriptionskomplex an biotinylierter DNA aufgebaut und an Streptavidin-Tabletten und -Kügelchen immobilisiert wird, wodurch ein gestoppter RNAP-Elongationskomplex entsteht. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, vorgefertigte, gabelartige DNA an den RNAP-Elongationskomplex zu ligieren, um einen Replikationsgabel untenstrom der frontal angeordneten RNAP zu bilden.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Repli-Zone zusammenzubauen und die Synthese des vorangehenden Strangs an der Replikationsgabel zu initiieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Isolierung der DNA von den magnetischen Perlen und die Reinigung der DNA über eine PCR-Reinigungssäule. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass die Replikation bei einer Kollision mit dem entgegenkommenden Transkriptionskomplex durch ein alkalines Agarosegel der gereinigten, radioaktiv markierten DNA-Produkte zum Stillstand kommt.

Hallo, ich bin Richard Pomerance aus dem Labor von Mike O'Donnell an der Rockefeller University. Heute zeige ich Ihnen das Verfahren, wie man eine Kollision eines Ribosoms mit einer frontal aufeinanderprallenden RNA-Polymerase in fester Phase durchführt. In unserem Labor verwende ich dieses Verfahren, um zu untersuchen, wie der Replikationsprozess durch Transkriptionskomplexe entlang der DNA beeinflusst wird.

Beginnen wir also. Mischen Sie zu Beginn des Protokolls das RNAP-Holoenzym mit einer biotinylierten 3,6-KB-DNA-Vorlage, die den T7A1-Promotor enthält, in 100 Mikroliter Puffer A, und inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der 10-minütigen Inkubation fügen Sie die Ribonukleotide Adenosintriphosphat, Cytidintriphosphat und Adenosinuridintriphosphat hinzu, wodurch die RNA-Synthese auf 20 Nukleotide begrenzt wird.

Die Lösung weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um den angehaltenen RNAP-Elongationskomplex an die Kügelchen zu binden. Die Lösung zu streptavidinbeschichteten magnetischen Kügelchen geben. Die Mischung 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen.

Reinigen Sie den immobilisierten, angehaltenen RNAP-Elongationskomplex, indem Sie die Kügelchen mit 0,9 Milliliter Hochsalz-Puffer waschen. Um unspezifische R-N-A-P-D-N-A-Komplexe nach jedem Waschschritt zu entfernen, entfernen Sie den Überstand durch magnetische Trennung. Dieser Waschschritt sollte fünfmal wiederholt werden.

Danach sollten die Kügelchen noch zweimal mit 0,9 Millilitern Puffer A gewaschen werden. Nach dem letzten Waschschritt kann die nachgeschaltete Replikationsgabel assembliert werden, um eine Replikationsgabel stromabwärts des frontal aufeinandertreffenden RNAP-Transkriptionskomplexes zu bilden; suspendieren Sie den magnetischen Streifen mit den an den angehaltenen RNAP-Elongationskomplex gebundenen Kügelchen in 100 Mikrolitern New England Biolabs Puffer vier. Geben Sie anschließend 10 Einheiten Shrimp-Alkalische Phosphatase oder SAP1 hinzu und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 0,9 Millilitern Puffer A. Suspendieren Sie die Kügelchen danach in 50 Mikrolitern Schnell-T4-Ligationspuffer.

Fügen Sie zwei Mikroliter schnelle T4-Ligase und vorgefertigte, gegabelte DNA hinzu und inkubieren Sie die Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Perlen abschließend dreimal mit 0,9 Millilitern Puffer A. Mischen Sie den Hexamer- und DNAB-Helikasekomplex mit den magnetischen Strep-A-Perlen, die an den angehaltenen RNAP-Elongationskomplex und die nachgeschaltete Replikationsgabel gebunden sind. Bereiten Sie die Lösung in 150 Mikrolitern Puffer A vor und inkubieren Sie sie 30 Sekunden bei 23 Grad Celsius.

Nach der kurzen 32. Inkubation bei 23 Grad Celsius. Zur Polymerase drei Beta-Klammer A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alpha P 32 markiertes dGTP und alpha P 32 markiertes dATP auf ein Volumen von 200 Mikrolitern. Inkubieren Sie die Probe fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.

Starten Sie die Replikation durch Zugabe von Einzelstrang-DNA-bindendem Protein, DCTP und DTTP. Geben Sie außerdem alpha-P-32-markiertes DTTP und DCTP auf ein Endvolumen von 250 Mikrolitern. Beenden Sie die Reaktionen nach 10 Minuten durch Zugabe von 12 Mikrolitern 0,5-molarer EDTA.

Als Nächstes die Strp din-Beads aufkochen, um die DNA aus den Beads freizusetzen. Reste der DNA durch Behandlung der Beads mit Proteinase K für 30 Minuten bei 50 Grad Celsius entfernen. Die Beads erneut aufkochen und das Überstand durch magnetische Trennung abtrennen.

Reinigen Sie das kombinierte Überstand, das die DNA enthält, mithilfe des Kyogen-PCR-Reinigungskits. Analysieren Sie abschließend die gereinigten radioaktiv markierten DNA-Produkte in einem alkalischen Agarosegel. Die Kollision der Zone mit einer frontal auf RNAP führt gewöhnlich zu zwei Produkten mit einer Länge von 2,5 KB und 3,6 KB. Das 2,5-KB-Produkt repräsentiert die Länge der DNA von der Gabel bis zum angehaltenen RNAP.

Dieses Ergebnis beruht auf der Stagnation der Replikation infolge einer Kollision mit der RNAP. Das 3,6-KB-Produkt stellt vollständige DNA dar und entsteht entweder durch unvollständige Besetzung des Promotors durch RNAP oder durch teilweisen Durchgang der Replikation durch die entgegenkommende RNAP. Ein gutes Ergebnis zeigt, dass etwa 50 % vollständige DNA produziert werden.

Es kommt jedoch in einigen Fällen zu einer geringeren Besetzung des Promotors durch RNAP und ein höherer Prozentsatz vollständiger DNA wird beobachtet. Dies liegt daran, dass eine größere Anzahl von Repli-Zonen keine entgegenkommende RNAP-Replikation trifft; in Abwesenheit eines angehaltenen RNAP entsteht ausschließlich vollständige DNA. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Replikation und die Festphasenreaktion in Gegenwart eines am DNA gebundenen angehaltenen RNA-Polymerase-Elongationskomplexes durchführt. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, den angehaltenen Transkriptionskomplex mit hoher Salzkonzentration zu waschen, um überschüssige RNA-Polymerase zu entfernen, die unspezifisch an die DNA bindet und die Replikation hemmt.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.