Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Einfachheit der Durchführung einer Western Blot-Analyse unter Verwendung geeigneter Produkte zu demonstrieren. Nach der Probenvorbereitung werden die Proteine entsprechend ihrer Größe getrennt und anschließend auf eine feste Phase übertragen. Die Proteine werden dann mit Antikörpern nachgewiesen, und die Anwendung geeigneter Protokolle sowie hochwertiger, kosteneffizienter Reagenzien führt zu verbesserten Western Blot-Ergebnissen.

Hallo, ich bin Jesse Luhan, Forschungs- und Entwicklungswissenschaftler bei EMD Chemicals in San Diego, Kalifornien. EMD ist eine Tochtergesellschaft von Merck KGaA in Darmstadt, Deutschland. Heute werden wir Ihnen ein Western-Blot-Verfahren zeigen.

Beginnen wir also. Der erste Schritt beim Western Blot ist die Probenvorbereitung. Starten Sie die Probenvorbereitung, indem Sie die Zellen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletieren, beispielsweise fünf Minuten bei 2.500 ×g.

Nach der Zentrifugation die Zellpellets abpipettieren. Die Zellen gut in CytoBuster-Protein-Extraktionsreagenz resuspendieren, wobei 150 Mikroliter pro 106 Zellen verwendet werden. Die Probe fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Als Nächstes wird die Probe fünf Minuten bei 16.000 × g und vier Grad Celsius nach der Zentrifugation zentrifugiert. Überführen Sie das geklärte SNA in ein frisches Gefäß und fahren Sie mit der Analyse fort. Nachdem die Proteinkonzentration der Probe bestimmt wurde, bereiten Sie die Probe zum Beladen des Gels vor, um das Protein zu denaturieren.

Verwenden Sie einen Probenpuffer, der ein ionisches denaturierendes Detergens wie Natriumlaurylsulfat oder SDS enthält. Erhitzen Sie das Gemisch fünf Minuten lang auf 95 bis 100 Grad Celsius. Mithilfe eines kommerziell erhältlichen vorgefertigten Gels können Proteine schnell entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt werden.

Füllen Sie die Elektrophoreseeinheit mit Laufpuffer, der aus Reagenzien der Omni-PU-Chemikalienreihe hergestellt werden kann. Beladen Sie die erste Spur des Wells mit dem Trail-Mix-Proteinkalibrierungsmarker. Dieser Marker verfügt über drei Referenzbanden, die eine Überwachung während der Elektrophorese ermöglichen.

Nach der Färbung des Gels sind 10 Banden sichtbar, die von 10 bis 225 Kilodalton reichen. Geben Sie die denaturierte Probe in die verbleibenden Vertiefungen. Führen Sie das Gel eine Stunde lang bei 220 Volt durch.

Nachdem sich die Proteine getrennt haben, färben Sie das Gel mit Kumasisierblau, um sicherzustellen, dass die Proteine gleichmäßig und einheitlich migriert sind, unter Verwendung einer Schnellfärbung und einer ultrav sensitiven Färbung, die gebrauchsfertig ist, ohne dass ein DS-Färbeschritt erforderlich ist. Genauso wie Proteine mit elektrischer Ladung durch ein elektrisches Feld durch ein Gel bewegt werden können, können die Proteine in einem elektrischen Feld vom Gel auf eine Membran wie NITROCELLULOSE oder PVDF übertragen werden. Bei Verwendung von PVDF-Membranen tauchen Sie die Membran einige Minuten in Methanol ein, gefolgt von einer Äquilibration in eiskaltem Transferpuffer für fünf Minuten. Tauchen Sie außerdem das Gel einige Minuten in eiskalten Transferpuffer ein; die Äquilibration verhindert eine Schrumpfung des Gels während des Transfers.

Bei einem nassen Transfer wird ein Sandwich aus Gel und Membran zwischen Schwamm und Papier zusammengestellt. Danach wird die Anordnung fest zusammengedrückt, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keine Luftblasen zwischen Gel und Membran gebildet haben. Das Sandwich wird in Transferpuffer getaucht und ein elektrisches Feld angelegt.

Die negativ geladenen Proteine wandern zur positiv geladenen Elektrode. Die Membran hält sie dann an, bindet sie und verhindert, dass sie weiterwandern. Nach Abschluss der Übertragung sollten die Proteine sichtbar gemacht werden, um eine gleichmäßige Übertragung ohne Luftblasen zu überprüfen.

Dies kann problemlos mit dem roten Western-Blot-Farbstoff („red alert Western blot stain“) durchgeführt werden. Dieser Farbstoff ist gebrauchsfertig, und die Entfärbung kann einfach mit Wasser erfolgen. Dies ist das Gel, nachdem es durch Waschen mit Wasser entfärbt wurde. Bevor die Membran mit Antikörpern nachgewiesen werden kann, wird sie blockiert.

Um unspezifische Bindungen zu verhindern, blockieren Sie die Membran mit hochwertigen Blockierreagenzien. Um einen erhöhten Hintergrund zu vermeiden, inkubieren Sie die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren in der Blockierungslösung und waschen Sie die Membran anschließend dreimal in TBST oder PBST. Diese Puffer können einfach und bequem mit TBS-Tween-Tabletten bzw. PBS-Tween-Tabletten hergestellt werden.

Nach dem Blockieren und Waschen der Membran kann diese mit dem primären Antikörper inkubiert werden. Geben Sie den primären Antikörper unter Verwendung der Lösung eins, einem Signalverstärker, auf, wodurch das Signal erheblich verstärkt werden kann. Bereiten Sie den primären Antikörper in Lösung eins vor und inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang.

Es ist nicht erforderlich, nach der Inkubation weitere Blockiermittel hinzuzufügen. Waschen Sie die Membran mit TBST. Anschließend inkubieren Sie die Membran mit dem sekundären Antikörper, der in Lösung zwei von Signal Boost verdünnt ist, für eine Stunde.

Spülen Sie die Membran abschließend mehrmals mit TBST für HRP-konjugierte Sekundärantikörper. Der Nachweis erfolgt traditionell mittels verstärkter Chemilumineszenz oder ECL. Das ECL-Reagens im Rapid-Schritt-Verfahren wird verwendet, da kein Mischen von Luminol oder Enhancer erforderlich ist.

Sprühen Sie die Membran einfach mehrmals an, inkubieren Sie sie zwei Minuten lang und entwickeln Sie sie anschließend mit Röntgenfilm. Rapid Step bietet eine Empfindlichkeit im niedrigen Pikogramm-Bereich sowie eine schwächere Emission für bis zu zwei Stunden nach Zugabe des Substrats. Die Verwendung von Trail-Mix-Proteinmarkern ermöglicht die Verfolgung der Proteine während der Elektrophorese im Vergleich zu Standard-Western-Blot-Protokollen.

Signal Boost ermöglicht einen größeren dynamischen Bereich und höhere Empfindlichkeit. Schließlich kann durch die Verwendung von Rapid im Vergleich zu herkömmlichen ECL-Reagenzien eine überlegene Empfindlichkeit erzielt werden. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Western Blotting effizient und kostengünstig mit einer umfassenden Produktpalette durchführt.

Denken Sie daran, dass die Qualität Ihrer Ergebnisse von der Qualität Ihrer Reagenzien abhängt. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.