Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine hohe Transfektionsrate in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen durch optimierte Transfektions- und Kerntransportprotokolle zu erreichen. Dies wird erreicht, indem zunächst kulturgeeignete, feederfreie Kulturen humaner induzierter pluripotenter Stammzellen etabliert werden. Für die Transfektion werden die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen über Nacht auf Gelt, TRX oder Matrigel ausgesät.

Während für die Nukleofektion kleine Zellklumpen durch Trypsin gewonnen werden, wird ein Gemisch aus Plasmid-DNA und einem GenJuice-Transfektionsreagenz den angesiedelten Zellen zugegeben, anschließend wird die Platte zentrifugiert und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Die humane iPS-Zellsuspension wird in einem Nukleofektionsgerät nukleofiziert, die Zellen werden in Meth-konditioniertem Medium resuspendiert und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine effiziente genetische Modifikation durch hohe Transfektionseffizienz in humanen iPS-Zellen belegen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der zuvor beschriebenen Transfektions-Elektroporation und den Methoden zur nukleären Beeinflussung besteht darin, dass in unserem Labor routinemäßig eine hohe Transfektions-Effizienz in humanen iPS-Zellen mit konsistenten Ergebnissen erzielt werden kann. Unsere Protokolle gewährleisten zudem einen minimalen Zelltod nach der genetischen Modifikation. Folglich ermöglichen unsere Protokolle eine schnelle und großskalige Erzeugung transgener humaner iPS-Zelllinien. Bevor humane induzierte pluripotente Stammzellen an kultivbedingte Freikulturen angepasst werden, bereiten Sie Geltrex-beschichtete Schalen vor.

Als Nächstes massieren Sie die zuvor auf Fütterzellen kultivierten humanen IPCs in einem Milliliter Accutane pro Vertiefung und inkubieren bei 37 Grad Celsius für eine Minute, bis die meisten Zellen beginnen, sich zu lösen. Geben Sie dann 10 bis 15 Glasperlen zu den Zellen hinzu und schwenken Sie die Platte vorsichtig. Anschließend zwei Milliliter Knockout D-M-E-M-F 12 hinzufügen und vorsichtig pipettieren. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Zellen 3 Minuten lang mit 800 U/min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie das Überstand, wobei das humanen iPS-Zell-Pellet intakt bleibt. Schlagen Sie das Röhrchen vorsichtig an, um das Zellpellet sanft zu lösen.

Reese, suspendieren Sie das humane IPSC-Pellet in einem geeigneten Volumen STEM pro Medium und verteilen Sie es auf die Vertiefungen einer mit Gel-TRE beschichteten Platte. Je nach Proliferationsrate können humane IPCs im Spaltverhältnis von eins zu zwei bis eins zu sechs weitergegeben werden. Stellen Sie die Platte vorsichtig in einen 5 %igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 °C und schwenken Sie die Platte sanft, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den Vertiefungen sicherzustellen.

Füttern Sie die Zellen täglich. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen, sind sie bereit, erneut auf ein neues Gel überführt zu werden. Für die Transfektion sollten die Zellen am Tag der Transfektion in einem Rex-beschichteten Wells bei einer Aufteilung im Verhältnis 1:2 eine Konfluenz von etwa 40 bis 50 % aufweisen und sich in kleinen Kolonien gleichmäßig über das gelbeschichtete Wells verteilen, um eine optimale Transfektionseffizienz zu erzielen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie 100 Mikroliter Knockout-Medium in einem sterilen 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen vor. Geben Sie 27 Mikroliter GeneJuice-Transfektionsreagenz hinzu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie es fünf Minuten bei Raumtemperatur. Als Nächstes geben Sie vier Mikrogramm Plasmid-DNA hinzu.

Die Wahl des Plasmids ist entscheidend für eine optimale Transfektionseffizienz. Das hier verwendete Plasmid enthält ein durch einen CAG-Promotor angetriebenes verbessertes grün fluoreszierendes Protein, ein starker Promotor, der in humanen IPCs transkriptionell aktiv ist. Inkubieren Sie das Reagenzglas bei Raumtemperatur für 15 Minuten.

Nach 15 Minuten das Gene-Juice-DNA-Gemisch den Zellen hinzufügen und die Platte schwellen lassen. Die Platte fünf Minuten lang bei 1.200 U/min zentrifugieren, um den Kontakt des Transfektionsgemischs mit den humanen IPCs im Wells zu erhöhen. Die Zellen am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Überwachen Sie die Transfektionseffizienz am Tag der nukleären Behandlung. Behandeln Sie humane IPCs vorab mit 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor für mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius, während die humanen iPS-Zellen vorbehandelt werden. Bereiten Sie 82 Mikroliter Lösung für nukleäre Effektoren aus menschlichen Stammzellen in einem sterilen 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen vor. Geben Sie 80 Mikroliter hinzu.

Ergänzen Sie Supplement eins und mischen Sie es durch Pipettieren gut. Inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Wärmen Sie zuvor vorbereitetes, konditioniertes Medium von Futterzellen und 0,25 % Tripsin in EDTA auf 37 Grad Celsius unter dem Abzug vor.

Beschriften Sie vorab eine sterile 15-Milliliter-Kegelrohr. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus der humanen iPSC-Kultur, die kernübertragen werden soll, und waschen Sie die Zellen sanft mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Aspirieren Sie den PBS und geben Sie Trypsin hinzu; inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für drei Minuten.

Für eine erfolgreiche Nukleotid-Affektion ist es entscheidend, die Zellen nicht mit Trypsin in Einzelzellen zu lösen. Stattdessen sollten die Zellen durch Pipettieren in kleine Zellhaufen mit zwei bis drei Zellen aufgetrennt werden. Vorsichtig die Zellen mit einer P-1000-Pipettenspitze zu kleinen Zellhaufen bestehend aus zwei bis drei Zellen umrühren.

Spülen Sie den Boden des Wells durch mehrfaches Pipettieren, um sicherzustellen, dass alle menschlichen IPCs vollständig abgelöst sind. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in den beschrifteten 15-Milliliter-Konikalrohr. Fügen Sie anschließend neun Milliliter Kulturmedium für murine embryonale Fibroblasten hinzu.

Um die Trypsin-Aktivität zu stoppen, zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 U/min für drei Minuten. Aspirieren Sie vorsichtig den Überstand, wobei das Zellpellet intakt bleibt. Suspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern einer vorher erwärmten humanen Stammzell-Nukleareffektorlösung.

Überführen Sie die Zellen mithilfe einer 1-milli-Liter-Pipettenspitze in ein Nuklear-Effektor-Vial. Geben Sie 4 µg Plasmid-DNA in die Zellsuspension im Vial und mischen Sie Zellen und DNA durch vorsichtiges Schwenken. Klopfen Sie das Vial zweimal auf die Oberfläche des Abzugs.

Setzen Sie die Vete in den Kern-Effektorhalter des Kern-Effektorgeräts ein. Wählen Sie Programm B 0 1 6 aus, um die Kern-Effektorzellen zu aktivieren, indem Sie die Taste x drücken. „Okay“ wird angezeigt, wenn der Kerntransfektionsvorgang abgeschlossen ist, was gewöhnlich eine bis fünf Sekunden dauert. Verwenden Sie die im Kerntransfektionskit bereitgestellte Plastik-Pasteurpipette, um die transfizierten Zellen aus der Vete zu gewinnen. Lösen Sie die Zellen durch Resuspendierung in vorgewärmtem CM mit Rock-Inhibitor in einem sterilen 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen auf und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach 10 Minuten die Zellen mithilfe einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze tropfenweise auf die Futterzellschichten überführen. Die Zellen am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Transfektions-Effizienz überwachen.

Hier gezeigte Fotomikrografien von EGFP-exprimierenden RIV-einen menschlichen iPSC-Zellen, die mittels Gene-Juice auf Gel Rex 12 Stunden nach der Transfektion mit Plasmid-DNA transfiziert wurden. DNA-Transfektion menschlicher iPSCs. Die Verwendung von Gene Juice mit einem starken Promotor führt typischerweise in einem transienten Transfektionsassay zu mehr als 60 % EGFP-Reporter-exprimierender Zellen.

EGFP-exprimierende Zellen können ebenfalls durch nukleare Transfektion erhalten werden, wie in diesen Bildern von RIV-eins menschlichen IPCs gezeigt, die nach nuklearer Transfektion unter Verwendung entweder des B 0 1 6-Programms oder des A 0 2 3-Programms für die nukleare Transfektion auf Futterzellen platziert und gebildet wurden. Die Verwendung des B 0 1 6-Programms führt zu bis zu 80 % EGFP-positiven Zellen, während das A 0 2 3-Programm weniger als 10 % EGFP-positive Zellen ergab. Darüber hinaus können stabile Klone transgener menschlicher iPSCs, die das Trendgen exprimieren, gewonnen werden.

Ein Beispiel stabiler humaner iPS-Zellkolonien mit stabiler EGFP-Expression, die durch Genjuice erzeugt wurde und eine ubiquitäre EGFP-Expression aufweist, wird hier gezeigt. Diese Zellen behalten während der Embryoidkörper-Differenzierung eine konstitutive EGFP-Expression bei. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane iPS-Zellen nukleofizieren und transfizieren kann.

Eine effiziente genetische Manipulation ist ein unverzichtbares Werkzeug, um verschiedene Aspekte der Stammzellbiologie zu untersuchen, und wird die Nutzung menschlicher iPS-Zelllinien in der regenerativen Medizin beschleunigen.