Ein PCR-basierte Genotypisierung Methode, zwischen Wildtyp-und Ziersorten Unterscheiden von Imperata cylindrica

Das Hauptziel dieses Verfahrens besteht darin, ein kostengünstiges und schnelles molekulares Genotypisierungsprotokoll bereitzustellen, das zwischen Sorten von Retta cylindrica – gewöhnlich als Gon-Gras bezeichnet – unterscheiden kann, die allein anhand ihrer Morphologie nicht zu differenzieren sind. Dies wird erreicht, indem zunächst Gewebe einer interessierenden Gon-Gras-Sorte identifiziert und isoliert wird. Der nächste Schritt besteht darin, nukleäre und plastidäre DNA aus dem gesammelten Gewebe zu extrahieren.

Als Nächstes wird eine Polymerase-Kettenreaktion mit der extrahierten DNA unter Verwendung sortenspezifischer Primer durchgeführt, die Sequenzunterschiede im PLAs-turn-LF-Bereich sowie geeignete positive und negative Kontrollen gezielt ansprechen. Der letzte Schritt besteht darin, eine Gelelektrophorese für jede der vier PCR-Reaktionen durchzuführen, um die amplifizierten PCR-Produkte sichtbar zu machen. Letztendlich wird die gesammelte Sorte von Ungras durch die Analyse der resultierenden sortenspezifischen PCR-Produktbänder im Gel bestimmt. Invasive Pflanzen verursachen den Vereinigten Staaten jährlich Kosten in Höhe von etwa 3,4 Milliarden Dollar und schädigen sowohl landwirtschaftliche als auch natürliche Ressourcen erheblich.

Wildtyp imparato Electrica, auch bekannt als Cogan-Gras, ist eine der zehn schlimmsten invasiven Unkräuter weltweit. Cogan-Gras bildet rasch wachsende Monokulturen aus, die die einheimische Vegetation verdrängen und damit auch die Tiere beeinträchtigen, die von dieser Vegetation abhängen. Derzeit befallen Cogan-Gras weltweit etwa 490 Millionen Hektar, darunter rund 500.000 Hektar in den Vereinigten Staaten. Eine Zierform von ti von tus centrica wird unter den Namen tus Centrica, Arbra, red Baren und Japanese blood grass – im Folgenden als JBG bezeichnet – breit vermarktet. Diese Sorte gilt als voraussichtlich steril und nicht-invasiv und wird aufgrund ihrer rot gefärbten Blätter als wünschenswert angesehen.

Unter bestimmten Bedingungen kann der japanische Blutgras viable Samen produzieren und in eine vollständig grüne Form zurückverwandeln, die vom Wildtyp Cogongras nicht zu unterscheiden ist. Wie Sie sehen können, weisen beide eine grüne Blattfärbung auf und sind im Vergleich zur traditionellen Zierform mit größeren Blättern größer. Zusätzlich besitzen die zurückverwandelten und die Wildtyp-Pflanzen größere Rhizome als die Zierform, was ihr asexuelles Fortpflanzungspotential erhöht.

Die Rückmutation erschwert die Identifizierung allein anhand der Morphologie. Eine anspruchsvolle Aufgabe. Molekulare Methoden bieten eine Möglichkeit, invasive Pflanzen und Pflanzenmaterialien genau zu unterscheiden, die durch herkömmliche visuelle Methoden nicht identifiziert werden können.

Molekulare Methoden sind entscheidend, um die Ausbreitung und Einschleppung invasiver Pflanzen zu verhindern. Die Anwendung dieses molekularen Protokolls ermöglicht eine genaue Unterscheidung zwischen Rückmutanten von Japanese blood grass und Kogan-Gras. Dieses Protokoll kann dazu beitragen, ein gleichzeitiges Auftreten mit Kogan-Gras sowie die mögliche Bildung lebensfähiger Hybride zu verhindern.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der amplifizierten fragmentlängenbasierten Polymorphie (AFLP-Analyse) oder DNA-Sequenzierung besteht darin, dass sie eine sehr kostengünstige und schnelle molekulare Genotypisierungsmethode bietet, die leicht zwischen Wildtyp-Kogan-Gras und Sorten des Japanischen Blutgrases unterscheiden kann. Joseph Hery, ein Student aus unserem Labor, wird die Durchführung der Technik demonstrieren. Identifizieren Sie zunächst eine Probe an einem Standort, an dem Kogan-Gras oder Japanisches Blutgras wächst und zwischen beiden unterschieden werden muss.

Japanisches Blutgras lässt sich leicht durch seine leuchtend roten Blätter vom Wildtyp-Gon-Gras unterscheiden. Der Revert des Japanischen Blutgrases ist jedoch vom Kogan-Gras nahezu nicht zu unterscheiden, da beide eine größere grüne Blattfläche, mehr Blattfläche und größere Rhizome aufweisen als das Zier-Japanische Blutgras. Diese Methode kann an frischem, gefrorenem und kürzlich getrocknetem Blattgewebe angewendet werden.

Wenn Gewebe für eine DNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt gelagert werden sollen, ist die beste Methode, das Gewebe sofort bei minus 80 Grad Celsius einzufrieren und aufzubewahren. Falls eine Trockenlagerung erforderlich ist, legen Sie das Gewebe in einen Papierschein und bewahren Sie diesen bei Raumtemperatur in getrocknetem Kieselgel oder einem anderen wirksamen Trockenmittel auf. Wenn frisches Gewebe verwendet wird, stellen Sie sicher, dass die DNA innerhalb von drei Stunden nach der Sammlung extrahiert wird, um eine Zersetzung zu verhindern.

Dieses Verfahren verwendet das DNEZ Plants Mini-Kit von Kyogen gemäß den Herstelleranweisungen mit einer geringfügigen Modifikation. Das Verfahren wurde so angepasst, dass mehr als 100 Milligramm frisches oder gefrorenes Gewebe oder mehr als 20 Milligramm getrocknetes Gewebe verwendet werden. Zuerst werden mehr als 100 Milligramm frisches oder gefrorenes Blattgewebe oder mehr als 20 Milligramm trockenes Blattgewebe unter Verwendung von drei Portionen flüssigem Stickstoff in einer gekühlten Mörser- und Pistillmühle zu einem feinen Pulver zermahlen.

Wiegen Sie das gefrorene Pulver aus frischem oder gefrorenem Gewebe in Portionen zu je 100 Milligramm ab. Bei Verwendung von trockenem Blattgewebe wiegen Sie das Pulver in Portionen zu je 20 Milligramm ab. Danach führen Sie die DNA-Extraktion gemäß den Herstelleranweisungen durch, unter Verwendung eines Spektrophotometers wie beispielsweise des NanoDrop-Spektrophotometer-Tests. DNA-Qualität und -quantität: Gute DNA-Ausbeuten sollten zwischen 50 und 150 Nanogramm pro Mikroliter liegen, mit A260/A280- und A230/A280-Verhältnissen nahe bei 2,0, wie hier gezeigt.

Führen Sie die Elektrophorese unter Verwendung eines standardmäßigen 1 %igen AROS-Gels durch. Überprüfen Sie das Vorhandensein relativ großer Banden größer als 10 KB, wobei keine oder nur geringe Verschmierung durch RNA-Kontamination auftreten sollte. Falls die DNA-Konzentration hoch ist, verdünnen Sie die Proben für nachfolgende Schritte auf 70 Nanogramm pro Mikroliter. Die in diesem Protokoll verwendeten PCR-Primer, die durch die roten und grünen Pfeile gekennzeichnet sind, basieren auf Sequenzunterschieden im Spacerbereich des plissierten Fuchsschweif-LF zwischen Cogan-Gras- und Japanisches-Blutgras-Genotypen.

Diese Unterschiede liegen in Form von Einzelnukleotid-Polymorphismen und Insertionen sowie Deletionen vor, die durch die vertikalen schwarzen Pfeile gekennzeichnet sind und die Entwicklung sortenspezifischer Primer ermöglichen. Indem die Primer an den Stellen eindeutiger Sequenzen platziert werden, sind die Primersequenzen im schriftlichen Teil des Protokolls enthalten; für jeden isolierten DNA-Probe richten Sie zwei 50-Mikroliter-PCR-Reaktionen in 0,2-Milliliter-Dünnewand-PCR-Röhrchen auf Eis mit jedem Primer-Set gemäß dem schriftlichen Protokoll ein. Falls die DNA-Konzentration niedrig ist, kann mehr DNA zu jeder Reaktion hinzugefügt werden, wobei die Menge an nukleasefreiem zweifach destilliertem Wasser so angepasst wird, dass das Gesamtvolumen der Reaktion weiterhin 50 Mikroliter beträgt.

Verwenden Sie nicht mehr als fünf Mikroliter DNA oder 10 % des Gesamtvolumens pro Reaktion, da Verunreinigungen in den DNA-Proben die PCR-Reaktionen hemmen können. Um sicherzustellen, dass alle PCR-Reagenzien funktionieren, richten Sie eine positive Kontrolle ein. Richten Sie mithilfe der positiven Kontrollprimer eine negative Kontrolle ein, wobei Sie denselben Kontrollprimer-Satz wie bei der positiven Kontrolle verwenden, jedoch doppelt destilliertes Wasser anstelle der extrahierten DNA zusetzen. An diesem Punkt liegen insgesamt vier PCR-Reaktionen für jede zu testende Probe vor. Führen Sie anschließend die PCR-Amplifikationen in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel durch, wobei Sie die im schriftlichen Protokoll angegebenen PCR-Zyklusparameter verwenden. Eine Optimierung der Annealing-Temperatur, der Verlängerungszeiten und der Anzahl der Zyklen kann je nach Qualität der DNA, der Primer, der verwendeten Polymerase oder des Typs des Thermocyclers erforderlich sein.

Nach Abschluss der PCR-Reaktionen werden die PCR-Produkte mittels Standard-Elektrophorese auf einem 1 %igen Gel getrennt. Führen Sie die Proben bei etwa 120 Volt durch, bis sich die Lauffront bis zu drei Vierteln der Gesamtlänge des Gels bewegt hat. Sichtbaren Sie das Gel unter UV-Licht und überprüfen Sie die resultierenden Banden, um festzustellen, ob ein geeignetes DNA-Fragment amplifiziert wurde.

Dieses repräsentative Gel zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese von PCR-Produkten, die aus DNA-Proben von Kogan-Gras, Japanischem Blutgras und revertiertem Japanischem Blutgras in Kombination mit spezifischen Primern für Kogan-Gras und JBG sowie der Turn-LF-positiven Kontrolle und einer negativen Kontrolle ohne Template stammen. Der Primer-Satz für die Turn-LF-Positive Kontrolle funktioniert gleichermaßen gut für Cogan-Gras, Japanisches Blutgras, revertiertes Japanisches Blutgras und andere Gräser und führt zu einem Band von 890 Basenpaaren. Sofern alle PCR-Reagenzien frei von DNA-Kontaminationen sind, ergibt die negative Kontrolle kein PCR-Produkt.

Wenn die DNA-Probe von Wildtyp-Kogan-Gras stammt, führt eine PCR-Reaktion mit dem auf Kogan-Gras spezifischen Primer-Set zu einem einzelnen Band bei etwa 595 Basenpaaren, während die auf JBG spezifischen Primer kein Band ergeben. Ebenso führt, wenn die DNA-Probe von JBG oder einer revertierten J-B-G-A-P-C-R-Reaktion stammt, die Verwendung des auf JBG spezifischen Primer-Sets zu einem einzelnen Band bei etwa 594 Basenpaaren, während die auf Kogan-Gras spezifischen Primer kein Band ergeben.

Da JBG und revertiertes JBG dieselbe Nukleinsäuresequenz besitzen, weisen sie daher identische Bandmuster auf. Die morphologischen Unterschiede zwischen JBG und JBG-Revertanten sind jedoch ziemlich offensichtlich, sodass, obwohl die PCR-Ergebnisse gleich sind, die JBG-Varietäten auf Pflanzenebene leicht zu unterscheiden sind. Die DNA-Sequenzierung der PCR-Produkte kann mögliche Veränderungen in den DNA-Sequenzen verschiedener Cogan-Gras-Ekotypen identifizieren.

Die Entwicklung dieser Technik stellt die erste vereinfachte molekulare Methode bereit, die präzise zwischen dem Wildtyp K und Gras sowie der revertierten Form seiner Zierform Japanisches Blutgras unterscheiden kann. Wir ermutigen Anwender dieses Protokolls, uns zu kontaktieren, um Ergebnisse mitzuteilen, die durch die Anwendung dieses Protokolls erzielt wurden. Solche geteilten Informationen werden dazu beitragen, Kenntnisse über die Verbreitung des Japanischen Blutgrases zu gewinnen.

Dies wird auch den Aufsichtsbehörden des USDA dabei helfen, fundierte Entscheidungen über Maßnahmen zu treffen, die möglicherweise erforderlich sind, um die Ausbreitung und potenzielle Hybridisierung der stark invasiven Cogan-Grass-Sorten zu verhindern.