Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, humane pluripotente Stammzellen oder H PSCs in Neuronen zu differenzieren, und zwar mithilfe eines Multi-Titerplattenformats. Dies wird erreicht, indem eine Einzelzell-Suspension von H PSCs gewonnen und in V-Boden-96-Well-Platten ausplattiert wird, um über Nacht Embryoidkörper oder EBS zu bilden.

Anschließend werden die EBs in U-förmige Ultra-Low-Attachment-Platten mit Differenzierungsmedium überführt, um die Bildung von Neuroektoderm zu induzieren. Danach werden die EBs auf mit Matrigel beschichtete Schalen ausplattiert, um das Auswachsen von Neuronen zu fördern. Ergebnisse können ab etwa Tag acht mittels Immunfluoreszenz erzielt werden, die das Vorhandensein typischer neuronaler Marker zeigen.

Färbeprotokolle zur Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Neuronen sind oft kompliziert und mühsam. Zufälligerweise stießen wir auf ein äußerst einfaches Verfahren, um Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen herzustellen.

Aus technischer Sicht liegt der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren in ihrer einfachen Durchführung, Schnelligkeit und Kosteneffizienz. Gleichzeitig wird Dr. MI Z aus dem Labor das Verfahren vorstellen. Bereiten Sie das EB-Bildungsmedium und das Differenzierungsmedium gemäß dem schriftlichen Protokoll vor.

Züchten Sie hPSCs unter fütterzellenfreien Bedingungen, beispielsweise in einem auf MEF-bedingtem Medium auf Matrigel-beschichteten Platten oder unter Verwendung chemisch definierter Kultursysteme unter subkonzluenten, aktiv wachsenden Bedingungen. Mit einem Stereomikroskop und einer sterilen Plastikpipettenspitze werden spontan differenzierte Kolonien mechanisch entfernt. Die verbleibenden undifferenzierten Kolonien werden mit PBS gewaschen und mit Accutase, das einen × ROCK-Inhibitor enthält, zu Einzelzellen verdaut.

Die Einzelzellen durch Zentrifugation bei 200 × g für zwei Minuten pelletieren und in einem kleinen Volumen des EB-Bildungsmediums resuspendieren. Mit einem Hämozytometer die Zellkonzentration bestimmen. Weitere Zellen dem verbleibenden EB-Bildungsmedium hinzufügen, um eine Konzentration zwischen 40.000 und 80.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen.

Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter pro Vertiefung in eine 96-V-Bodenplatte, sodass 4.000 bis 8.000 Zellen pro Vertiefung vorliegen. Zentrifugieren Sie die Platte in einer Schwenkarmplatten-Zentrifuge bei 400 × g für eine Minute, um alle Zellen am Boden der Vertiefungen zu sammeln. Überführen Sie die Zellen in einen Inkubator und lassen Sie unter dem Stereomikroskop am nächsten Tag über Nacht EBS bilden.

Sammeln Sie EBS und überführen Sie sie in einem kleinen Volumen in eine 3,5 cm große bakterielle Petrischale, die zwei Milliliter Differenzierungsmedium enthält. Waschen Sie die Zellen, indem Sie die Schale vorsichtig rotieren. Geben Sie 100 Mikroliter Differenzierungsmedium in jedes Loch einer Ultra-Low-Attachment-Platte.

Untere 96-Well-Platte unter einem Stereomikroskop. Überführen Sie EBS in kleinen Volumina aus der Waschschale in die 96 U-förmigen Vertiefungen. Inkubieren Sie die EBS vier Tage lang, um am vierten Tag die Bildung von Neuroektoderm zu ermöglichen.

Waschen Sie die Zellen in Differenzierungsmedium und säen Sie sie einzeln in die Vertiefungen einer mit Matrigel beschichteten Mehrfachkulturplatte, beispielsweise einer 12-Loch-Platte. Die Zellen sollten gleichmäßig auf die Vertiefungen verteilt werden, um ein ungestörtes Auswachsen der Neuronen zu ermöglichen. Lassen Sie die EBS etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur locker an das Matrigel andocken.

Überführen Sie die Platte anschließend vorsichtig in den Inkubator. Innerhalb der nächsten vier Tage wachsen die Neuronen sternförmig aus den platzierten EBS heraus. Zuvor haben wir gezeigt, dass EBS aus H-PSCs, wie bereits von vielen anderen beschrieben, einfach durch Umpflanzen von Aggregaten beim routinemäßigen Teilen von H-HPCs in Platten mit geringer Anhaftung generiert werden können.

Dies führt normalerweise zu einer breiten Verteilung der Zellgrößen. Ein weiteres Problem ist, dass in Suspension kultivierte EBS dazu neigen, miteinander zu aggregieren, was zu einer noch höheren Größenheterogenität führt. Um dieses Problem zu umgehen, wurden einzelne H-PSCs in Low-Attachment-Gruben ausgesät, was jedoch weder zur EB-Bildung noch zum Zelltod führte. Durch die Kombination des Zellüberlebensmoleküls Y 2 7 6 3 2 mit Polyvinylalkohol, dessen positive Wirkung auf die EB-Bildung aus HSCs bereits nachgewiesen wurde, war es jedoch möglich, innerhalb einer Nacht EBS aus Einzelzell-Suspensionen von HESCs bilden zu lassen.

Bequemerweise konnten EB-Größen in diesem Multi-Titerplattenformat durch die Ansiedlung unterschiedlicher Zellzahlen pro Mulde exakt gesteuert werden. Im Gegensatz zur Verwendung herkömmlicher Techniken wurde nach dem Transfer der EBs in Ultra-Low-Attachment-96-U-Platten die Bildung des Neuroektoderms mittels eines Cocktails aus kleinen Molekülen induziert, der F-G-F-E-R-K-T-G-, TGF beta SMA zwei- und BP SMA eins-Inhibitoren enthielt, wodurch die Zellen anschließend auf Matrigel ausplattiert werden konnten, um Neuronen hervorzubringen. Die Initiierung der EB-Bildung aus etwa 8.000 Zellen ergab die beste neuronale Differenzierungskapazität, gekennzeichnet durch ausgeprägte neuronale Auswüchse aus den ausplattierten EBs.

Verringerte nekrotische EB-Zentren nach dem Ausplattieren und hohe Expression von sensorischen sowie pan-neuronalen Markern wie B rrn three A und beta three Tubulin. Die Gesamteffizienz der neuronalen Differenzierung scheint mit der ursprünglichen Methode vergleichbar zu sein, die bisher sowohl auf HSCs als auch auf HI PSCs anwendbar ist. Drei unabhängige HPSC-Linien, sowohl HES- als auch HIPS-Zellen, wurden erfolgreich im Multiwell-Verfahren getestet, wobei zelllinienabhängige Variabilität und unterschiedliche Differenzierungseffizienzen grundsätzlich nicht ausgeschlossen werden können.

Diese Abbildung zeigt dissoziierte einzelne neuroektodermale Zellen vom Tag vier, die als Einzelzellen ausplattiert wurden und mit einer Effizienz von etwa 60 % erfolgreich differenziert wurden. Das Handhaben von EBS in der Multi-Titer-Plattform erfordert am Anfang etwas Übung, aber nach einiger Zeit werden Sie feststellen, dass es recht einfach ist.