A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, quantitativ die Fitness von Mikrobenkulturen parallel auf genomweiter Ebene präzise und mit hoher Durchsatzkapazität zu erfassen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine geordnete Bibliothek mikrobieller Kolonien in 96-Loch-Platten hergestellt und die Kultur bis zur Sättigung wachsen gelassen wird. Anschließend werden die gesättigten Kulturen in Wasser verdünnt und auf feste Agarplatten aufgeimpft.

Anschließend werden die festen Agarplatten in regelmäßigen Abständen fotografiert, bis das Wachstum der mikrobiellen Kolonie gesättigt ist. Schließlich werden die zeitlich aufeinanderfolgenden Aufnahmen des Wachstums jeder Kultur in quantitative Maße der Zelldichte umgewandelt, und die beobachteten Wachstumskurven werden mit Wachstumsmodellen verglichen, um quantitative Parameter der mikrobiellen Fitness zusammenzufassen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Hinweise auf genetische Interaktionen liefern, indem gezeigt wird, dass mikrobielle Stämme unterschiedliche Fitnesswerte aufweisen, entweder in Kombination mit verschiedenen Mutationen oder beim Wachstum unter verschiedenen Bedingungen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie hochdichten Pinning-Methoden, beispielsweise SGA, oder Barcode-Konkurrenzexperimenten liegt darin, dass die Fitness-Messungen genauer sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Krebsmedikamentenentwicklung zu beantworten, etwa welche Gene und Prozesse bei der Antwort auf DNA-Schäden und der Kontrolle des Zellzyklus wichtig sind, und dabei unterstützen, solche Forschungsergebnisse anhand grundlegender Mikroorganismen als potenzielle Wirkstoffziele in menschlichen Krebszellen zu verstehen und umzusetzen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Telomerfunktion und visi ermöglichen kann.

Sie kann auch auf andere Bereiche der Hefebiologie oder tatsächlich auf jeden Bereich angewendet werden, in dem Fitness-Phänotypen Einblicke in die Mikrobiologie ermöglichen. Wir hoffen, dass die QFA auf viele andere mikrobielle Organismen angewendet werden kann, für die Array-Bibliotheken existieren. Zum Beispiel povi e coli, orilla surplus Ausgehend von gesättigten Übernachtkulturen wurden bis zu 96 unabhängige Hefestämme in 200 Mikroliter Volumina reichhaltigen flüssigen Medium aufgespielt.

In einer 96-Loch-Kulturschale sterilisieren Sie einen 96er-Pin, einen manuellen Replikator mit einem Durchmesser von einem Achtel Zoll, indem Sie ihn zuerst in 100 % Ethanol eintauchen, dann abbrennen und abkühlen lassen. Geben Sie 200 Mikroliter sterilem Wasser in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Vortexen Sie die gesättigten Hefekulturen und verdünnen Sie sie, indem Sie das sterilisierte Pin-Werkzeug dreimal in die Stämme eintauchen, dann einmal in die Platte mit Wasser. Sterilisieren Sie das Pin-Werkzeug erneut und lassen Sie es abkühlen, bevor Sie es dreimal in die verdünnten Kulturen eintauchen. Übertragen Sie anschließend den Pin auf eine feste Agarplatte.

Nach der Inkubation der Agarplatten verwenden Sie einen s und p robotics SP-Bilderzeuger, um sie manuell zur automatisierten Kultivierung abzubilden. Beginnen Sie mit einem rechteckigen Array unabhängiger Hefe-Stämme, die auf festem Agar gezüchtet wurden. In diesem Beispiel sind die Ausgangsstämme das Ergebnis einer Kreuzung einer temperatursensitiven Untersuchungsmutation mit der Hefe-Deletionskollektion.

1.536 Kulturen, die vier Wiederholungen von 384 unabhängigen Hefe-Stämmen darstellen, werden auf SGA-Platten mithilfe eines Roboters mit einem sterilen Pin-Tool mit 96 Pins und einem Pin-Durchmesser von einem Millimeter angezüchtet, wobei 384 der 1.536 Stämme in vier 96-Well-Kulturplatten mit jeweils 200 µL selektivem Medium übertragen werden. Die Kulturen werden bei 20 °C bis zur Sättigung inkubiert. Um die gesättigten Hefe-Kulturen aufzutragen, überführen Sie diese zunächst auf einen Flüssigkeits-Handhabungsroboter und resuspendieren sie auf einem magnetischen Schüttler. Verdünnen Sie die Kulturen anschließend durch Auftrag mit einem sterilen 96-Pin-Roboter-Pin-Tool in 200 µL steriles Wasser auf etwa 1:70.

Nach der Reinigung und Sterilisation des Pin-Tools werden die verdünnten Kulturen auf Agarplatten aufgetragen. In einem 384-Loch-Format werden die Platten in einen temperaturgesteuerten, befeuchteten Inkubator mit automatischem Karussell und Zugangsöffnung transferiert. Zur Bildaufnahme der Kulturen wird ein robotischer, automatisierter Bildanalysesystem verwendet, das die Platten wiederholt aus dem Inkubator entnimmt, die Deckel abhebt, sie in einen gleichmäßig beleuchteten Bereich unter einer 35-Millimeter-Kamera positioniert und ein Bild mit einer Auflösung von 5.184 mal 3.456 aufnimmt.

Die Pixelauflösung setzt den Deckel wieder auf, danach werden die Platten zurück in die Inkubatorkarussell gegeben, um die Positionen der Kulturen auf den Platten sowie die jeweils angewendeten Behandlungen nachverfolgen zu können. Die Platten werden automatisch anhand des Inkubatornamens, der Temperatur, einer eindeutigen fortlaufenden Batch-Nummer und der Position im Inkubator codiert. Die Bildnamen ergeben sich aus der Verkettung des Platten-Namens mit einem Zeitstempel und werden automatisch beim Erfassen des Bildes generiert.

Platten werden häufig auch manuell beschriftet, um sicherzustellen, dass sie bei der Übertragung zwischen Roboterkarussells in der gleichen Reihenfolge bleiben. Die Metadatendateien sind tabulatorgetrennte Textdateien, die manuell erstellt werden. Die Datei mit der Versuchsbeschreibung FT zwei.

Tabelle eins ist für jedes Experiment eindeutig, aber die Bibliotheksbeschreibung FT drei, Tabelle eins kann umfangreich wiederverwendet werden. Nach der Erstellung wird das Experiment in der experimentellen Beschreibungsdatei FT zwei, Tabelle eins beschrieben, die Spalten für Barcode oder automatisch generierten Plattenname, Experimentstart-Zeitstempel, Plattenbehandlung, Inhalt des festen Agars, Bildschirmname, Bibliotheksplattennummer für Bibliotheken mit mehreren Platten und eine Wiederholungsquadrantnummer für die Skalierung von einem 1.536-Loch-Format auf ein 384-Loch-Format enthält. Die e-Stammbibliothek wird mit einer Bibliotheksbeschreibungsdatei FT drei, Tabelle eins beschrieben, die das Genotyp angibt, das an jedem Kulturort angezüchtet wurde.

In jeder Platte einer Bibliothek sind die Spalten vier, Bibliotheksname, ORF, Plattennummer, Zeilen- und Spaltenposition der Platte sowie eine optionale Notizspalte enthalten. Optional kann eine Datei mit standardisierten Genbezeichnungen bereitgestellt werden (FT vier, Tabelle eins), die den jeweils zugeordneten standardisierten Genname für jede systematische ORFY-Nummer auflistet und so die identifizierten Stämme beschreibt, die untersucht werden. Diese Datei enthält zwei Spalten: ORF und Genname zur Analyse der Daten.

Der QFA-rechnergestützte Arbeitsablauf erfordert Zugriff auf eine leistungsfähige Mehrkern-Computerarbeitsstation, auf der das Colonizer-Bildanalyse-Softwaretool und das QFAR-Paket installiert sind. Beide Werkzeuge sind online dokumentiert, kostenlos verfügbar und laufen auf einer Reihe unterschiedlicher Betriebssysteme. Führen Sie Colonizer mit jeweils einem der erfassten Plattenbilder als Eingabe aus, wodurch pro aufgenommenem Bild eine Colonizer-Ausgabedatei FT5, Tabelle 1 generiert wird. Diese Colonizer-Ausgabedateien enthalten Angaben zu Schätzwerten der Kultur-Dichte, Kulturfläche, -form und -farbe.

Für jede der 384 Positionen auf der Bildplatte wird automatisch ein Ausgabedateiname aus dem Quelldateinamen der Bildakte übernommen. Das QFAR-Paket enthält Funktionen, um Dichtewahlen über die Zeit für jede Kultur durchzuführen, um verallgemeinerte logistische Populationsmodelle an die Beobachtungen anzupassen und diese abzubilden. Siehe Abbildung zwei und drei für Beispiele.

Die angepassten Parameterwerte werden in QFA-logistische Parameterdateien geschrieben. Das QFAR-Paket enthält außerdem Funktionen zur Qualitätskontrolle. Randkolonien werden verworfen, da am Rand der Platte mehr Nährstoffe verfügbar sind und die Bildanalyse schwieriger ist.

In der Nähe von Plattenrändern und Kulturen, bei denen der SGA fehlschlug, sowie Genotypen mit Verknüpfung zu spezifischen Markergenen der Bildschirmung, werden von der Analyse ausgeschlossen. Verschiedene quantitative Fitnessmaße werden aus den Parametern des logistischen Populationsmodells für jede Kultur abgeleitet. Dazu gehören die maximale Populationsverdopplungsrate sowie die Anzahl der Teilungen von der Inokulation bis zur Sättigung für jeden Satz von replizierten Kulturen und für jede Fitnessdefinition.

Mehrere Zusammenfassungsstatistiken der Fitnessschätzungen werden berechnet: Mittelwert und Median der Fitness, Standardabweichung der Fitness sowie Anzahl der beobachteten Replikate. Die Zusammenfassungsstatistiken werden in QFA-Fitness-Zusammenfassungsdateien FT acht, Tabelle eins zur weiteren Analyse ausgegeben. Beispielsweise Berechnungen von genetischen Interaktionsscores FT neun, Tabelle eins.

Diese Abbildung zeigt eine typische Wachstumskurve auf logarithmischer Skala aus 384 QFA. Kulturen, die bei 20 Grad Celsius auf festem Agar wachsen, wurden mittels Colonizer quantifiziert; ein Anstieg der Zelldichte ist erstmals nach etwa zwei Tagen nachweisbar. Diese Verzögerung ist wahrscheinlich eine kombinierte Wirkung einer Anlaufphase nach der Inokulation auf dem festen Medium und einer unteren Nachweisgrenze für die Zelldichte.

Hier wurden 308 ähnliche Wachstumskurven von einer einzigen Platte erfasst. Beachten Sie, dass Stämme, die eine flache Linie zeigten, sehr krank oder tot waren. Diese Abbildung zeigt den Vergleich zweier genomweiter QFA-Screens zur Ableitung der Stärke genetischer Interaktionen.

Das QFAR-Paket beinhaltet außerdem Funktionen zur Erstellung der vorherigen Wachstumskurvenabbildung sowie zur Ausgabe von Ranglisten untersuchter Genotypen und Schätzungen der genetischen Interaktionsstärke. Zusammen mit einem Q-Wert für die Signifikanz der beobachteten GIS ermöglicht es, sobald die Methode beherrscht ist, ein vollständiges genomweites QF.A-Experiment mit vier Wiederholungen innerhalb von drei Wochen abzuschließen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, bei der Verfolgung und Benennung aller Platten und Bilder organisiert vorzugehen.

Alle Platten müssen korrekt orientiert und in der richtigen Reihenfolge beimpft und aufgetragen werden. Die Datenanalyse hängt von der Richtigkeit der durch den experimentellen Wissenschaftler erstellten Hilfstextdateien ab. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Fitness von Tausenden unabhängiger mikrobieller Kulturen schätzen kann.

Die Fitness wird geschätzt, indem bepunktete Kulturen, die auf festen Agarplatten wachsen, wiederholt fotografiert, die aufgezeichneten Bilder in Schätzungen der Zelldichte umgewandelt und Wachstumskurven erstellt werden. Durch mathematische Modellierung der Wachstumskurven erhält man quantitative Fitnessschätzungen, die anschließend verwendet werden können, um funktionelle Beziehungen zwischen Genprodukten im genomweiten Maßstab abzuleiten.