Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Hypoxiekammer mithilfe eines Durchflussverfahrens einzurichten und zu betreiben. Dies wird erreicht, indem die erforderlichen Schläuche, Kolben und Kammern für das Verfahren besorgt und hergestellt werden. Als zweiter Schritt wird der Sauerstoffflasche angeschlossen und die Durchflussrate ausgewählt, um den gewünschten Hypoxiegrad einzustellen.

Hydratisieren Sie das Gas, indem Sie es durch eine Blasenflasche leiten, die mit entionisiertem Wasser gefüllt ist. Schließen Sie das hydratisierte Gas an die Hypoxiekammer an und stellen Sie die Testproben in die Kammer, um sie hypoxischen Bedingungen auszusetzen. Es werden Ergebnisse erhalten, die eine Hi F1-abhängige embryonale Letalität unter Hypoxie zeigen, basierend auf der Beobachtung der Überlebensfähigkeit bis ins Erwachsenenalter.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Handschuhboxen liegt darin, dass sie einfach und kostengünstig im Labor herzustellen ist und eine genaue sowie reproduzierbare Gaskonzentration in der Umweltkammer ermöglicht. Während diese Methode Einblicke in die hypoxische Reaktion beim Fadenwurm C. elegans ermöglicht, kann sie auch an andere Systeme angepasst werden, einschließlich größerer Modellorganismen und Zellkulturen. Zusätzlich kann sie zur Untersuchung anderer Gase verwendet werden, darunter Kohlendioxid und Schwefelwasserstoff.

Dieses Protokoll zeigt, wie man eine Hypoxiekammer aufbaut. Das Gas wird in Druckgastanks mit definierten Sauerstoffkonzentrationen gespeichert, und ein zweistufiger Druckminderer wird angeschlossen. Das Gas strömt in den unteren Teil des Durchflussrohrs ein und tritt oben mit der korrekten Durchflussrate aus.

Das Gas strömt anschließend in die Blasenflasche, wo es befeuchtet wird. Anschließend gelangt das befeuchtete Gas über das Einlassventil in die Hypoxiekammer und setzt die Proben der Hypoxie aus. Schließlich entweicht das Gas über eine im Kammerdeckel angebrachte Öffnung in den Raum.

Eine Kristallisationsschale aus Pyrex oder eine Pfeilpack-Box kann als Gehäuse der Umweltkammer verwendet werden. Das Volumen des Behälters sollte minimal gehalten werden, und das Material muss gasundurchlässig sein. Bohren Sie ein Loch in eine Seite des Behälters mit einer Kohlenstoff- oder Diamantspitze und setzen Sie ein Kunststoff-Anschlussstück mit Schlauchtülle ein.

Mischen Sie das Epoxidharz vor dem Auftragen auf die Box und die Armatur. Wiederholen Sie anschließend denselben Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite des Behälters, wobei die zweite Bohrung versetzt zur ersten angeordnet ist. Um die turbulente Durchmischung zu erhöhen, verwenden Sie FEP- oder Nylonrohr mit einem Außendurchmesser von einem Achtel Zoll, um die Druckgasflaschen mit einer Durchflussregelvorrichtung, wie beispielsweise einem Massendurchflussregler oder einem Flügelradzähler, zu verbinden.

Die Gastanks sollten definierte Sauerstoffkonzentrationen enthalten, die mit Stickstoff ausgeglichen sind und einem zertifizierten Standard für den Sauerstoffgehalt oder für anoxische Bedingungen entsprechen. Bei Verwendung von reinem Stickstoff verwenden Sie einen Zweistufenregler, wobei die zweite Stufe auf den gewünschten Druck eingestellt wird. Siehe die Anweisungen im schriftlichen Protokoll zur Auswahl einer geeigneten Durchflussrate.

Verbinden Sie dann den Schlauch vom zweistufigen Druckminderer mit dem Durchflussrohr, das die Strömungsgeschwindigkeit des in die Kammer eintretenden Gases reguliert. Die Ausgänge des Durchflussrohrs sind mit einer Gaswaschflasche verbunden, die einen porösen Zylinder mit destilliertem Wasser enthält. Anschließend verbinden Sie den Schlauch auf der anderen Seite der Waschflasche mit einem der Anschlüsse an der Umweltkammer.

Dadurch wird das in die Umweltkammer eintretende Gas befeuchtet. Versiegeln Sie die Kammer mit Vakuumfett. Anschließend platzieren Sie Gewichte auf dem Deckel der Kammer, um eine luftdichte Abdichtung sicherzustellen.

Überprüfen Sie die Dichtheit, indem Sie eine kleine Menge Wasser in der Handfläche eines behandschuhten Hands auf die Gasaustrittsöffnung der Kammer halten und auf Bläschenbildung prüfen. Erzeugen Sie zunächst synchronisierte Populationen von Seeeiern. Stellen Sie ein bis 100 GR-Erwachsene in einen Tropfen alkalischer Bleichlösung auf die Oberfläche einer unbeimpften Nematoden-Wachstumsmedium-Platte.

Lassen Sie die Bleichlösung nach einer Inkubationszeit von mindestens acht Stunden in die Platte eindringen. Überführen Sie die synchronisierten L1-Larven auf eine Platte, die mit lebenden OP50-Bakterien besiedelt wurde. Alternativ lassen Sie GRA-Adulttiere zwei bis drei Stunden lang Eier auf der Platte ablegen, um eine Gruppe von Würmern zu erzeugen, die synchron entwickeln, oder isolieren Sie L4-Larven aus einer gemischten Population, um junge Embryonen zu gewinnen.

Im Zweizell- bis Vierzellstadium GR-Erwachsene mit einem Rasiermesser in einem kleinen Volumen Wasser zerkleinern und die Embryonen anschließend mit einer Mundpipette umsetzen, bevor die Würmer zur Exposition gegenüber hypoxischen Bedingungen auf die Platte gebracht werden. Einen Ring aus 10 Milligramm pro Milliliter Palmitinsäure in Ethanol am Rand der Platten anbringen. Um zu verhindern, dass die Würmer die Oberfläche der Agarplatte verlassen.

Die Palmitinsäure scheidet sich aus der Lösung aus. Während das Ethanol verdampft und eine physikalische Barriere bildet, um Gleichmäßigkeit sicherzustellen, ersetzen Sie vor der Exposition in der Umweltkammer unbedingt das Wasser im Gaswaschflaschenbehälter. Nach dem Übertragen der Würmer auf die Platten verschließen Sie die Platten in der Umweltkammer, starten Sie den Gasfluss und führen Sie die Exposition für die gewünschte Versuchszeitdauer durch.

Um die Überlebensfähigkeit der Embryonen bis zum Erwachsenenstadium zu bestimmen, lassen Sie die Würmer 48 Stunden nach der Rückkehr zur Raumluft weiterentwickeln, wobei sie sich zu diesem Zeitpunkt im Stadium der vierten Larvenentwicklungsstufe oder als ein Tage alter Erwachsener befinden sollten. Werten Sie die Überlebensfähigkeit bis zum Erwachsenenstadium anhand dieser Stadien aus. Um die Würmer nach einer hypoxischen Exposition sichtbar zu machen, überführen Sie die Würmer in einen Tropfen M9 auf einem 22 Millimeter quadratischen Deckglas und invertieren dieses bei Bedarf auf ein Polster aus 2 % Agar in M9.

25 Millimolar Amol oder 10 Millimolar Natriumazid können als Anästhetikum verwendet werden. Alternativ kann nach Exposition gegenüber Hypoxie die durchsichtige Umweltkammer direkt auf den Objekttisch eines Stereomikroskops gestellt werden. Es werden zwei Ansichten gezeigt, eine inklusive der gesamten Gasdurchflussanordnung.

Die andere mit nur der Kammer auf dem Mikroskopstadium. Züchten Sie Bristol N zwei Würmer auf vier Wachstumsplatten mit 10 Zentimeter Durchmesser, bis die Mehrheit der Würmer GR-Erwachsene sind. Spülen Sie die Würmer mit einer alkalischen Bleichlösung im Verhältnis 1:5 in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und inkubieren Sie unter Rühren, bis die Würmer beginnen sich aufzulösen.

Nicht länger als fünf Minuten. Die Würmer dreimal mit M9 waschen, wobei nach jeder Wäsche bei 1.500 ×g zentrifugiert wird, ohne dabei die Pellets aufzubrechen. Die gebleichten Embryonen auf acht 150-Millimeter-NGM-Platten ausplattieren und die Embryonen etwa 48 Stunden lang zu L4-Larven entwickeln lassen.

Bei 22 Grad Celsius die Platten in die Umweltkammer bringen und vier Stunden lang oder gemäß der vom Versuchsdesign vorgegebenen Dauer hypoxischen und anoxischen Bedingungen aussetzen. Um die Proben schnell zu entnehmen, den Deckel der hypoxischen Kammer entfernen. Eine Probenplatte entnehmen, die Kammer erneut verschließen und Zeitpunkt sowie Schritte dokumentieren.

Nach dem Entfernen der Würmer aus der Hypoxie sollte dieser gesamte Vorgang weniger als zwei Minuten dauern. Verwenden Sie destilliertes Wasser, um die Würmer auf einen Nylonfilter zu spülen, und gießen Sie sie dann in ein beschriftetes 15-Milliliter-Konischglas, das 100 Mikroliter 1 % SDS enthält. Die Würmer in SDS werden in einer Tischzentrifuge 15 bis 20 Sekunden bei 1.500 × g zentrifugiert.

Unterbrechen Sie, und verwenden Sie ein Vakuum, um den größten Teil des Überstandes aus dem Röhrchen zu entfernen, wobei das Wurmpellet unberührt bleibt. Überführen Sie das Wurmpellet mithilfe einer Pipette zusammen mit einem vorbestimmten Volumen Flüssigkeit in ein beschriftetes 1,5-Mikroliter-Röhrchen. Falls die Probe für eine SDS-Gelelektrophorese verwendet werden soll, kann dieses Röhrchen ein gleiches Volumen an zweifach konzentrierter Protein-Ladefarbe enthalten; verschließen Sie das Röhrchen und tauchen Sie es in flüssigen Stickstoff.

Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Proben isoliert wurden. Befolgen Sie diese Verfahren für Kontrollproben der Raumluft; Konsistenzproben können bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Diese Abbildung zeigt die Lebensfähigkeit von Embryonen, die 1000 Teilen pro Million Sauerstoff, 5.000 Teilen pro Million Sauerstoff und Normoxie mit etwa 210.000 Teilen pro Million Sauerstoff ausgesetzt waren.

Die Embryonen werden 24 Stunden lang in Durchfluss-Sauerstoffkammern jeweils einer Bedingung ausgesetzt. Die Würmer wurden in normoxische Bedingungen überführt, durften 48 Stunden lang bis zum Erwachsenenstadium entwickeln und anschließend hinsichtlich ihrer Überlebensfähigkeit bis zum Erwachsenenstadium bewertet. Nach diesem Verfahren können Proben für nachfolgende Analysen mittels Western Blot, QPCR oder physiologischer Assays wie Lebensdauer- oder Nachkommenschaftsproduktion gesammelt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie eine kontinuierliche Durchfluss-Hypoxiekammer in Ihrem eigenen Labor aufbauen können.