A Simple Protocol für das Extrahieren Hämozyten von Wild Caterpillars

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Hämocyten aus wildlebenden Raupen zu extrahieren, sichtbar zu machen und zu zählen. Dies wird erreicht, indem die Raupe zunächst durch Platzieren auf Eis betäubt, dann mit einer Pufferlösung, die ein Antikoagulans enthält, injiziert und anschließend wieder auf das Eis zurückgelegt wird, um den Hämocyten zu ermöglichen, erneut in den Kreislauf einzutreten, bevor die Extraktion erfolgt. Der zweite Schritt besteht darin, am hinteren Ende der Raupe mit einem sauberen Skalpell einen flachen Einschnitt vorzunehmen.

Anschließend wird die Raupe vorsichtig mit einer weichen Pinzette zusammengedrückt. Dann wird die Gemisch aus Pufferlösung und Hämolymphe mit einer Mikropipette abgesaugt und in einem Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt. Im letzten Schritt wird die Hämolymphe-Lösung vorsichtig mit einem gleichen Volumen an Pufferlösung vermischt und 10 Mikroliter der Lösung auf ein Hämozytometer übertragen, um die Anzahl der Hämocyten sichtbar zu machen und zu zählen.

Schließlich kann diese Hämocyten-Extraktionsmethode als schnelle und effektive Methode zur Zählung von Hämocyten verschiedener Raupearten verwendet werden und dient als Werkzeug zur Untersuchung physiologischer Aspekte der zellulären Immunantwort der Insekten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur Gewinnung von Hämocyten aus Raupen mit sehr reduziertem Prox eingesetzt werden kann. Andere Raupe-Modelle werden durch Anschneiden eines Pros geblutet, wobei die Hämocyten aus der austretenden Flüssigkeit gewonnen werden.

Außerdem kann diese Technik zur Gewinnung von Hämocyten aus anderen Insektenarten verwendet werden. Diese Methode kann dazu dienen, zentrale Fragen im Bereich der ökologischen Immunologie zu beantworten, beispielsweise wie die zelluläre Immunantwort von Insekten mit der Nahrungsqualität, dem Entwicklungsstadium oder der Exposition gegenüber verschiedenen Krankheitserregern variiert. Um dieses Verfahren zu beginnen, betäuben Sie die vorletzten Larvenstadien, indem Sie sie 20 Minuten vor der Hämocytenentnahme auf Eis abkühlen.

Danach das stumpfe Ende einer sauberen Kapillarnadel mit 16 Gauge in den Schlauch einführen, der mit einer 20-Milliliter-Glasspritze verbunden ist. Das Gefäß mit der Sammellösung offen auf dem Labortisch stehen lassen. Die Kapillare langsam mit etwa 10 bis 15 Mikroliter Puffer füllen.

Dann legen Sie die Nadel auf einen Tonballen, der neben dem Stereomikroskop platziert ist. Geben Sie die Raupe in eine Petrischale. Das Insekt sollte seitlich liegend positioniert werden, sodass die Sphären deutlich sichtbar sind.

Während der Beobachtung unter einem Stereomikroskop halten Sie die Raupe mit einer Pinzette fest und setzen die Nadel nahe an eine der Sphären an, wo das Insektenexoskelett in der Regel weicher ist. Drücken Sie dann vorsichtig die Kapillarnadel gegen den Körper des Insekts. Sobald die Nadel das Exoskelett durchdrungen hat, injizieren Sie das gesamte Lösungsvolumen in die Raupe.

Der Körper der Raupe wird nach der Injektion anschwellen, sollte aber nicht platzen oder austreten. Stellen Sie die Raupe zurück in die gekühlte Petrischale. Positionieren Sie das Insekt dorsal, um ein Auslaufen des Puffers aus der Wunde zu verhindern.

Wiederholen Sie die Injektionen für jede Raupe, die zur Hämolymphe-Gewinnung verwendet wird. Anschließend lassen Sie alle Insekten 30 Minuten lang auf Eis abkühlen. Stellen Sie nun die Raupe unter dem Stereomikroskop in eine Petrischale.

Führen Sie vorsichtig einen flachen Schnitt von etwa zwei bis drei Millimetern Länge im hinteren Bereich der Raupe mit einem sterilen Skalpell durch, ohne den Darm oder andere innere Organe zu beschädigen. Drücken Sie anschließend die Raupe vorsichtig mit einem Paar flexibler Plastikpinzette zusammen, während Sie mithilfe einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze etwa 10 bis 20 Mikroliter der Hämolymphe sammeln. Achten Sie erneut darauf, das innere Gewebe nicht zu verletzen.

Danach verwerfen Sie die Reste der Raupen. Sammeln Sie das Hämolymphe jeder einzelnen Raupe in getrennt beschrifteten silanisierten Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 0,5 Milliliter. Geben Sie danach etwa 10 bis 20 Mikroliter der Inkubationslösung zu jeder aus einer einzelnen Raupe gewonnenen Hämolymphe-Probe hinzu.

Halten Sie die Hämolymphe-Proben während dieses gesamten Schritts stets auf Eis. Mischen Sie die Hämolymphe-Probe und die Inkubationslösung unmittelbar vor der Zählung. He cytes.

Diese Behandlung ermöglicht eine ordnungsgemäße Trennung der Hämocyten und verhindert Verklumpungen. Verwenden Sie eine saubere Pipettenspitze, um 10 Mikroliter der mit der Inkubationslösung gemischten Hämolympheprobe auf ein Hämozytometer zu übertragen. Zählen und notieren Sie anschließend mithilfe eines Mikroskops die Anzahl der Hämocyten in mindestens 15 der großen Quadrate des zentralen Rasters des Hämozytometers.

Addieren Sie diese Werte, um eine Gesamtsumme der Anzahl der Hämocyten in den 15 Quadraten zu erhalten. Spülen Sie anschließend das Hämozytometer und seinen Deckel gründlich mit einer Waschflasche, die mit destilliertem und entionisiertem Wasser gefüllt ist. Wischen Sie es danach mit Kim-Tüchern trocken.

Wiederholen Sie die Verfahren für die übrigen Hämolymphe-Proben und berechnen Sie die mittlere Anzahl der Hämozyten pro Milliliter Hämolymphevolumen für jede Raupe. Die Hellfeld-Mikroskopieaufnahme zeigt die extrahierten Hämozyten aus Nuclehin-ai-Raupen bei einer 20-fachen Vergrößerung. Mit dieser Methode gewonnene Hämozyten können anschließend zur Untersuchung der zellulären Immunantwort verwendet und für Assays wie Phagozytose und CAP, selektive Einschließung sowie pH-Oxidase-Aktivität eingesetzt werden.

Außerdem können R-N-A-D-N-A und Protein ungenutzt für weitere Assays gesammelt werden, um diese zellulären Immunantworten bei Insekten zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Raupen injiziert, um Hämolymphe zu gewinnen, und wie man Hämolymphe, die lebende Hämocyten enthält, sammelt.