Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität von KV-sieben-Kaliumkanälen in frisch dissoziierten glatten Muskelzellen der Mesenterialarterie zu messen und diese mit Durchmesser-Messungen der Arterie unter physiologischen Bedingungen in Beziehung zu setzen. Dies wird erreicht, indem zunächst die mesenteriale Gefäßbogenstruktur von einer Ratte chirurgisch entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, Segmente der Mesenterialarterien zu isolieren und zu reinigen.

Anschließend werden einige Segmente verwendet, um einzelne glatte Muskelzellen zur Durchführung von Patch-Clamp-elektrophysiologischen Messungen der KV-sieben-Kaliumströme zu isolieren. Der letzte Schritt besteht in der Kanülierung intakter arterieller Segmente zur Druck-Myographie-Messung der arteriellen Konstriktion oder Dilatation als Reaktion auf pharmakologische Modulatoren der KV-sieben-Kaliumkanäle. Letztendlich wird die Kombination aus Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck-Myographie eingesetzt, um zu zeigen, wie eine Zunahme oder Abnahme der Aktivität der KV-sieben-Kaliumkanäle die Konstriktion mesenterischer Arterien beeinflusst.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Verwendung von Klonkanälen, die in Zelllinien exprimiert werden, liegt darin, dass die Ströme aus nicht kultivierten Zellen aufgezeichnet werden, die die Kanäle nativ exprimieren, und dass die KV-Ströme von anderen Klassen von Kaliumkanälen isoliert werden können, die möglicherweise in denselben Zellen aktiviert werden. Die Druck-Myographie ermöglicht es, funktionelle Antworten aus demselben Gewebe aufzuzeichnen, aus dem die isolierten Zellen stammen, und die Methode ist sowohl empfindlicher als auch physiologischer als andere Präparationen wie arterielle Ring- oder Streifenpräparate. Dr. Bareth Mani, ein Postdoktorand aus meinem Labor, wird die arterielle Kanülierung und die Druck-Myographie-Techniken demonstrieren, und Dr. Luba Brueggeman, eine wissenschaftliche Assistentin in meinem Labor, wird die Zellisolations- und Patch-Plan-Verfahren demonstrieren.

Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um an beiden Enden des Dünndarms einer Ratte jeweils ein Segment von 10 bis 12 Zentimeter Länge abzuschneiden. Danach isolieren Sie den Darm zusammen mit der zugehörigen Gefäßversorgung. Befestigen Sie anschließend das Dünndarmsegment.

Verteilen Sie das Mesenterium über die nahe Seite der Kammer, sodass der Hauptast der Arteria mesenterica superior in der Mitte liegt und die folgenden Verzweigungsreihen von diesem Zentrum ausgehen. Stecken Sie die Nadeln dann ausschließlich an den Darmabschnitten fest, wobei Sie mithilfe eines beleuchteten Stereomikroskops arbeiten. Entfernen Sie vorsichtig das Fettgewebe und das Bindegewebe um die Arterien zweiter bis vierter Ordnung nahe dem Darm mithilfe von Mikrozangen und einer Schere.

Halten Sie die benachbarten Venen fest, um die Entfernung des Fettgewebes und des Bindegewebes zu erleichtern und eine unnötige Dehnung der Arterien zu vermeiden. Überführen Sie nun zwei bis drei Segmente der Mesenterialarterie in eine 35-Millimeter-Zellkulturschale, die zwei Milliliter eiskalte Isolationslösung enthält. Stellen Sie die Schale danach auf Eis und schneiden Sie die Segmente der Mesenterialarterie mit einer Pipette mit angeschliffener Spitze in drei bis vier Millimeter lange Stücke.

Überführen Sie die arteriellen Segmente in ein Glasfläschchen, das zwei Milliliter vorgewärmte Isolationslösung bei 37 Grad Celsius enthält. Anschließend inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach 30 Minuten saugen Sie die Isolationslösung bei 37 Grad Celsius vorsichtig mit einer Hintenpipette ab.

Geben Sie zwei Milliliter warme Enzymlösung hinzu und inkubieren Sie 35 Minuten bei 37 Grad Celsius. Unmittelbar nach der 35-minütigen Inkubation in der Enzymlösung stellen Sie das Gefäß auf Eis, saugen die Enzymlösung ab und geben zwei Milliliter eiskalte Isolationslösung hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal.

Dann die arteriellen Segmente in einem Milliliter eiskalter Isolationslösung vorsichtig 10 bis 20 Mal mit der polierten Hintertippipette auf- und abpipettieren, um einzelne glatte Muskelzellen der Mesenterialarterie freizusetzen. Überprüfen Sie regelmäßig das Erscheinungsbild der Myozyten, indem Sie einen Tropfen der Zellsuspension auf eine 35-Millimeter-Schale geben und unter dem Mikroskop betrachten.

Gesunde MA-SMCs sollten ein glattes, langgestrecktes Erscheinungsbild aufweisen. Überführen Sie anschließend etwa 100 bis 200 Mikroliter Zellsuspension mit einer polierten Pasteurpipette in die Messkammer und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang anhaften. Füllen Sie in diesem Schritt die Spitze der Patch-Pipette mit Amphotericin B, indem Sie die Pipettenspitze in die freie Innenslösung tauchen.

Anschließend an dem anderen Ende Unterdruck erzeugen, indem man eine 10-Milliliter-Spritze verwendet, die über ein Stück Schlauch verbunden ist, und gleichzeitig über die Spitze Pipettierungslösung aus dem Behälter B hinzufügt. Mit einer Eppendorf-Mikroladepipettenspitze fortfahren, bis die Pipette etwa zur Hälfte mit Lösung gefüllt ist. Eventuelle Luftblasen entfernen, indem man vorsichtig auf die Pipette klopft.

Danach setzen Sie die Pipette in den Elektrodenhalter ein. Senken Sie mithilfe eines Mikromanipulators die Pipette auf die Oberfläche eines langgestreckten Myozyten ab. Wenn der Widerstand der Pipette auf sechs bis zehn Megaohm ansteigt, erzeugen Sie Saugzug, um eine Gigasealung zu erreichen.

Gleichzeitig die Haltespannung auf null Millivolt einstellen, während auf die Membranperforation gewartet wird. Anschließend 100 Millisekunden dauernde Spannungsschritte auf plus 10 Millivolt und danach auf minus 10 Millivolt anlegen. Den Verstärker verwenden, um den schnellen Pipettenkapazitätsübergang zu kompensieren, der gleichzeitig mit dem Auftreten der Gesamtzellkapazität auftritt.

Transiente, kleine, anhaltende positive Ströme im Bereich von zwei bis 10 Picoampere, die sowohl Reinheit als auch Amplitude aufweisen, deuten auf das Vorhandensein funktioneller KV7-Kanäle hin. Eine erfolgreiche Perforation mit Amphotericin B verringert den Zugangswiderstand auf 35 Megaohm oder weniger. Um die Strom-Spannungs-Beziehung der KV7-Kanäle aufzuzeichnen, wenden Sie fünfsekündige Spannungsschritte auf Spannungen an, die von minus 84 Millivolt – bei der die Öffnungswahrscheinlichkeit der KV7-Kanäle minimal ist – bis zu plus 16 Millivolt reichen, bei der die Öffnungswahrscheinlichkeit der KV7-Kanäle ein Plateau erreicht. Nach fünf Sekunden bei jeder Testspannung kehren Sie für 10 Sekunden zur Haltespannung von minus vier Millivolt zurück.

Befestigen Sie in diesem Verfahren je zwei vorgefertigte feine Nylonfäden locker an jeder Seite. Überführen Sie das präparierte Mesenterialarteriensegment vorsichtig neben der Glaskanüle aus der Präparationskammer in die Druck-Myographenkammer, indem Sie ein Ende des Segments mit einer feinen Pinzette halten. Halten Sie danach ein Ende des Arteriensegments fest und schieben Sie es unter Sichtkontrolle durch ein beleuchtetes Stereomikroskop sanft über die linke Glaskanüle.

Befestigen Sie das Ende mit den Nylon-Nähten. Spülen Sie dann vorsichtig die Luminausflüssigkeit durch das montierte Gefäß, um Blut und Ablagerungen zu entfernen. Anschließend sollte das Ventil zur linken Spritze geschlossen werden, sodass diese Seite eine statische Flüssigkeitssäule bildet, gegen die der Druck von der rechten Seite aus justiert wird. Positionieren Sie mit dem Mikromanipulator die bewegliche rechte Glaskanüle näher an das Arteriensegment heran und ziehen Sie das rechte Ende des Segments darüber.

Schließen Sie das Arteriensegment abschließend mit Nylon-Nähten und schneiden Sie die überschüssigen Fäden ab. Bringen Sie nun die Druckgraphikeinheit auf dem Objekttisch über dem Druckmikrografiemikroskop an. Verbinden Sie die Drucksäule mit der rechten Seite der Graphikkammer und setzen Sie anschließend die Abdeckung auf die Kammer.

Erhöhen Sie die 10-Milliliter-Spritze allmählich über einen Zeitraum von 15 Minuten und prüfen Sie, ob Leckagen im Gefäß auftreten, bis das Druckmessgerät P1 einen Wert von 80 Millimeter Quecksilber anzeigt. Passen Sie den Abstand zwischen der Kanüle gegebenenfalls so an, dass das unter Druck stehende Arteriensegment annähernd gerade verläuft und dort, wo die Ligaturen angelegt sind, ein schulterartiges Muster bildet. Überprüfen Sie die Vitalität des montierten Gefäßes durch vorübergehende Überleitungsperfusion mit 60 Millimolar Kaliumchlorid für 30 Sekunden. Ein vitales Gefäß zieht sich rasch nach Zugabe von Kaliumchlorid zusammen und weitet sich unmittelbar nach dessen Ausspülung wieder.

Fügen Sie anschließend die konzentrierte Testsubstanz direkt in die Badelösung hinzu, indem Sie sie vorsichtig mit der Pipette mehrmals auf und ab bewegen, in der Nähe des Endes der Kammer, um die Testsubstanz in der Badelösung zu vermischen und die geeignete Endkonzentration in der 10-Milliliter-Kammer zu erreichen. Volumenänderungen im Gefäßdurchmesser nach Zugabe der Testsubstanz können im Live-Videobild überwacht und während des laufenden Experiments auch im Fenster der Bildanalyse grafisch dargestellt werden. Diese Abbildung zeigt eine Reihe aufeinanderfolgender Stromspuren, die als Reaktion auf Spannungsschritte vor der Behandlung (schwarz dargestellt) und nach der Stabilisierung in Gegenwart von 100 Nanomolar Zinkperion in einer einzelnen Myozyte der Mesenterialarterie (rot dargestellt) aufgezeichnet wurden. Hier sind die repräsentativen Ströme für die Kontrolle und für 100 Nanomolar Zinkperion gezeigt.

Die grauen Balken zeigen das Zeitintervall an, in dem die gemittelten Stromamplituden gemessen wurden. Bei Strom-Spannungs-Diagrammen sind die Schrittspannungen rechts durch Pfeilspitzen gekennzeichnet. Dargestellt ist der zeitliche Verlauf der KV-sieben-Stromverstärkung durch 100 Nanomolar Zinkionen, gemessen mittels kontinuierlichem Spannungs-Clamp bei minus 20 Millivolt. Hier sind die gemittelten Strom-Spannungs-Kurven dargestellt, die aus den KV-sieben-Stromdichten abgeleitet wurden, die vor und während der Behandlung mit 100 Nanomolar Zinkionen sowie während der Behandlung mit 10 Mikromolar des KV-sieben-Kanalblockers XC 991 aufgezeichnet wurden. Zinkioneninduzierte Relaxation der mesenterialen Arterie, die zuvor mit 100 Pikomolar Arginin-Vasopressin präkonstriktiert wurde.

Diese Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderungen des Außendurchmessers des Gefäßes als Reaktion auf die Applikation von 100 Pikomolar Arginin-Vasopressin, gefolgt von der Applikation von 100 Nanomolar Zinkionen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Arterien zur Isolierung einzelner Zellen oder zur druckmyographischen Messung arterieller Konstriktion und Dilatationsreaktionen vorbereitet. Außerdem sollten Sie wissen, wie man KV7-Ströme isoliert von anderen Strömen in frisch isolierten arteriellen Myozyten aufzeichnet.