Iterative Optimierung der DNA-Duplexes für Kristallisation von SeqA-DNA-Komplexen

Dieses Experiment beschreibt, wie man Kristalle von hoher Diffraktionsqualität eines an DNA gebundenen Proteins erhält, die eine tandemartige, halbmethylierte GATC-Sequenz enthalten. Wiederholen Sie diese Sequenz, um die Kristallpackung des Protein-DNA-Komplexes zu begünstigen. Beginnen Sie mit der rationalen Gestaltung der DNA-Länge, dem Abstand der GATC-Sequenzen und den DNA-Enden; verwenden Sie anschließend komplementäre einzelsträngige Oligonukleotide, um die DNA zu reinigen, und anschließend eine Methylierung, um den halbmethylierten DNA-Duplex herzustellen. Danach mischen Sie das gereinigte SeqA, um den Komplex zu bilden.

Als Nächstes werden optimale Bedingungen zur Züchtung von kristallen der Proteindesoxyribonukleinsäure (DNA)-Komplexe mit kristallisationsversuchen unter Verwendung kommerzieller Sparse-Matrix-Screens ermittelt, die eine für Beugungsexperimente geeignete Qualität aufweisen. Gezeigte Ergebnisse. Dargestellt wird der Einfluss variierender DNA-Länge, GATC-Abstände und Enden auf die Beugungsqualität der CQ A DNA-Kristalle.

Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, kristallisationsfähige Kristalle aus CK, das an DNA gebunden ist, zu erhalten; gleichzeitig kann sie jedoch auch dazu beitragen, die allgemeinen Variablen zu verstehen, die bei der Konstruktion von DNA-Duplexen für die Kristallisation anderer Protein-DNA-Komplexe berücksichtigt werden müssen. Dieses Verfahren wird von Chang, A., einem Doktoranden aus meinem Labor, angewandt. Die Studie nutzt eine Variante des DNA-Replikationsregulatorproteins Seek a, das stabile Dimere bildet und eine verkürzte Linkerregion zwischen seinen Dimerisierungs- und DNA-Bindedomänen aufweist.

Diese Variante beschränkt die DNA-Bindung auf tandemartige GATC-Wiederholungen, die ausschließlich durch eine Windung auf der DNA getrennt sind. Transformieren Sie zunächst BBL 20 1D-Dreierzellen mit dem Plasmid, das DEMETRIC seq A unter Kontrolle des T7-Promotors kodiert. Führen Sie die Transformationsreaktion auf LB-Agarplatten durch, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthalten, und inkubieren Sie sie über Nacht im Bakterieninkubator. Picken Sie gemischte Kolonien und initiieren Sie eine kleinmaßstäbliche Übernachtkultur.

Am nächsten Morgen die ein Liter Kultur mit 10 Milliliter des Übernachtkulturs beimpfen. Wenn die Kultur in der logarithmischen Phase ist, zwei Milliliter von 0,5 molarer IPTG zugeben, um die Proteinproduktion zu induzieren. Die Inkubation für drei Stunden in einem orbitalen Schüttler bei 37 Grad Celsius fortsetzen.

Anschießend die Zellen durch Zentrifugation bei 3.300 ×g für 10 Minuten pellettieren. Die Zell-Pellets in Puffer A zur Reinigung suspendieren, durch Sonifikation lysieren und das Lysat durch Zentrifugation bei 39.000 ×g für 40 Minuten klären. Den klaren Überstand (S-Überstand) dann auf eine mit Puffer A vorgespülte Heparin-Säule auftragen.

Um das CK-Protein zu eluieren, verwenden Sie einen linearen Gradienten bis zu einer Konzentration von einem Mol Natriumchlorid; das CK-Protein eluiert bei etwa 0,7 Mol Natriumchlorid. Sammeln Sie die Fraktionen, die CK enthalten, und verdünnen Sie diese, um die Ionenstärke der Probe zu senken.

Anschließend die Probe auf eine mit Puffer für die Reinigung vorgewaschene Kationenaustausch-Chromatographiesäule E auftragen. Einen linearen Salzgradienten anwenden, um das reine CK-Protein bei etwa 0,4 molaren Natriumchlorid zu eluieren. Die Fraktionen, die CK enthalten, vereinigen.

Konzentrieren Sie auf drei Milligramm pro Milliliter und lagern Sie in der Aufbewahrung. Pufferdesign komplementäre un- und methylierte Oligonukleotide. Bereiten Sie Proben von jeweils einem Mikromol lyophilisiertem Einzelstrang-DNA in 800 Mikrolitern autoklaviertem, zweifach destilliertem Wasser vor, wirbeln Sie und stellen Sie 15 Minuten beiseite, nun und 800 Mikrolitern.

Den Puffer mit doppelter Konzentration auf jedes Probe für 20 bis 30 Nukleotide lange Oligonukleotide vorheizen und ein großes 10%iges denaturierendes Gel vorbereiten. Nach der Polymerisation den Kamm entfernen und die Vertiefung gründlich spülen. Das Gel zusammenbauen, wobei die oberen und unteren Kammern mit Puffer für den Elektrophoresebetrieb in einfacher Konzentration (1× TBE) gefüllt werden.

Laufen Sie das Gel vorher bei 750 Volt, um das Gel auf 55 Grad Celsius aufzuwärmen. Stoppen Sie dann den Lauf und spülen Sie die Vertiefungen gründlich mit Laufpuffer aus. Erhitzen Sie nun die Oligonukleotide zwei Minuten lang auf 90 Grad Celsius.

Schwenken und zentrifugieren. Die Proben werden unverzüglich auf das Gel aufgetragen. Laufen Sie das Gel bei etwa 700 Volt, bis sich das Oligonukleotid bewegt hat.

In der Mitte eines 10 %igen Polyacrylamidgels wandert Bromphenolblau mit Oligonukleotiden mit einer Länge von etwa 20 Basen mit, und Xylencyanoll mit etwa 60 Basen langen Oligonukleotiden. Demontieren Sie das Gel aus der Apparatur und entfernen Sie die Abstandshalter auf einer flachen Oberfläche. Entfernen Sie eine Glasplatte und bedecken Sie das Gel mit Frischhaltefolie.

Danach das Gel umdrehen, die andere Glasplatte entfernen und das Gel mit Plastikfolie abdecken. Anschließend die Banden mit UV-Licht und einer fluoreszierenden Platte hinter dem Gel markieren. Um den DNA-Abdruck mit einem Rasierklingenblatt zu sehen, die Bande ausschneiden und in kleine Stücke zerschneiden.

Überführen Sie jede Probe in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie neun Milliliter Eluierpuffer hinzu und verdünnen Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Rühren. Übertragen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Gel-Ladepipettenspitze in ein Autoklav-Zentrifugenröhrchen.

Um die Übertragung von Acrylamid-Stücken zu vermeiden, geben Sie ein Milliliter dreimal milli Natriumacetat bei pH 7 sowie 25 Milliliter gekühlten 100 %igen Ethanol hinzu und inkubieren mindestens drei Stunden bei minus 20 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die ausgefallene DNA. Trocknen Sie die Pellets anschließend im Speed-Vac bei mittlerer Temperatur, lösen jedes Pellet in 400 Mikrolitern autoklaviertem, doppelt destilliertem Wasser auf und überführen es in ein frisches Gefäß.

Fügen Sie 40 Mikroliter dreimolares Natriumacetat bei pH 7 und ein Milliliter 100 % Ethanol hinzu, wirbeln Sie die Probe und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei minus 20 Grad Celsius. Anschließend zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 18.000 ×g, waschen die DNA-Pellets mit 100 Mikrolitern 70 % kaltem Ethanol, um restliche Salze zu entfernen, und zentrifugieren erneut sechs Minuten bei 18.000 ×g. Danach entsorgen Sie das Ethanol und trocknen das Pellet im Speed-Vac.

Resuspendieren Sie nun jedes Pellet in 100 Mikroliter autoklaviertem zweifach destilliertem Wasser. Bestimmen Sie die Konzentration der Oligonukleotide durch Spektrometrie. Zur Herstellung der hemimethylierten DNA-Duplexe werden zunächst äquimolare Konzentrationen der komplementären Einzelstränge gemischt.

Erhitzen Sie dann die Mischungen fünf Minuten lang in einem Wasserbad auf 95 Grad Celsius, um die Stränge zu denaturieren. Lassen Sie die Proben langsam im Wasserbad auf Raumtemperatur abkühlen. Kombinieren Sie gleiche Volumina von 81 µM gereinigtem CQ-Protein und 81 µM hemmethylierter DNA.

Anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius lagern. Auf Kristallisationsbedingungen mithilfe kommerzieller Sparse-Matrix-Screens testen. Sobald erste Kristallisationsansätze identifiziert wurden, optimieren Sie die Bedingungen, um kristallographisch brauchbare Kristalle zu erhalten. Zum Einfrieren und Schützen der resultierenden CK-DNA-Kristalle.

Erhöhen Sie entweder die Menge an PEG 400 in der Kristallisationslösung auf eine Endkonzentration von 25 % oder geben Sie 20 % Glycerin zur Kristallisationslösung hinzu. Heben Sie einzelne Kristalle mit einer Nylon-Schleife vorsichtig heraus und schocken Sie sie sofort. Gefrieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein.

Testen Sie nun die Beugungsgrenze jedes Kristalls bei 100 K. Um die Kristallstruktur des verkürzten Mutanten von CK in Bindung an hemimethylierte DNA zu erhalten, optimieren wir nacheinander drei Parameter an der DNA: den Abstand zwischen den hemimethylierten GATC-Sequenzen, die Länge des Duplexes sowie das Fehlen oder Vorhandensein von Fünf-End-Überhängen. Diese Studie verwendet eine DME-Variante von SeekA mit einer Punktmutation in der endständigen Domäne, die eine weitere Ligamentierung verhindert, sowie einen verkürzten Linker, der die DNA-Bindung auf Tandem beschränkt.

GATC-Wiederholungen, die im DNA-Elektrophoreseverschiebeassay ausschließlich durch eine Windung getrennt sind, zeigen an, dass das modifizierte CK-Protein bevorzugt GATC-Wiederholungen bindet, die durch neun bis zehn Basenpaare getrennt sind. Daher verwenden anfängliche Screening-Verfahren Duplexe mit einer Länge von 23 bis 24 Basenpaaren, die zwei hemi-methylierte GATC-Wiederholungen enthalten, die entweder durch neun oder zehn Basenpaare getrennt sind.

Drei Duplexe ergaben gut geformte Kristalle. Obwohl keiner der Kristalle bis zu hoher Auflösung diffraktierte, zeigten die Daten, dass eine A-G-A-T-C-Trennung von neun Basenpaaren für die Kristallisation bevorzugt wurde. Die unerwartete Einbindung eines CG-Dinukleotids zwischen den beiden GATC-Stellen verstärkte die Wechselwirkungen mit dem Rückgrat der Furche, veränderte jedoch nicht die Diffraktionsgrenze der Kristalle.

Im Gegensatz dazu veränderte die Optimierung der Länge der Überhänge die molekularen Kontakte und die Kristallmorphologie deutlich. Die Kristallstruktur dieses CK-Proteins, das an ein hem-methyliertes DNA-Duplex gebunden ist, bestätigte, dass die freie Fläche des DNA-Duplexes trotz der relativen Größe von Protein und DNA keine Kristallkontakte eingeht; die meisten Wechselwirkungen zwischen symmetrieverwandten Partnern werden durch Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen vermittelt. Interessanterweise beruht die positive Wirkung eines fünften Dinukleotid-Überhangs in diesem speziellen Fall nicht auf der Bildung einer pseudo-kontinuierlichen DNA.

Stattdessen ragt das 5′-Ende des methylierten Strangs von der DNA-Achse weg und wechselt mit dem benachbarten CK-Molekül des Komplexes, was erklärt, warum zwei Nukleotide zwingend notwendig waren, um die Kristallpackung zu verändern. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proteine reinigt und DNA-Duplexe für die Kristallisation von Protein-DNA-Komplexen entwirft. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass, obwohl dieses Protokoll zur Kristallisation des CK-DNA-Komplexes entwickelt wurde, die rationale Optimierung der DNA-Länge, -sequenz und -enden einen allgemeinen Rahmen für die Konstruktion von DNA-Duplexen zur Kristallisation anderer Protein-DNA-Komplexe bietet.