Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszenzmarkierte bakterielle Symbionten innerhalb ihres Nematodenwirts zu beobachten. Dies wird erreicht, indem die Bakterien zunächst durch Konjugation mit einem fluoreszierenden Protein markiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, AIC-Nematoden durch Gewinnung von Eiern zu isolieren.

Anschließend werden die AIC-Nematoden in Kombination mit ihrem fluoreszenzmarkierten bakteriellen Symbionten kultiviert, um eine natürliche Assoziation und letztlich die Lokalisation des bakteriellen Symbionten innerhalb des Nematodenwirts zu ermöglichen. Die Häufigkeit dieser Assoziation innerhalb der Nematodenpopulation kann mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Symbiose zu beantworten, beispielsweise, wo sich Bakterien innerhalb ihres Wirts lokalisiert haben, und wie die Verteilung der bakteriellen Besiedlung über eine Wirtspopulation aussieht.

Nach dem Übernacht-Wachstum der Bakterienstämme werden die Donator-, Rezipienten- und Helferstämme im Verhältnis 1:100 (Kultur zu Medium) in ein nährstoffreiches Wachstumsmedium ohne Antibiotika überimpft und anschließend bei der für jeden Stamm geeigneten Temperatur bis zum mittleren log-Phasen-Wachstum kultiviert. Danach werden die Stämme in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen vereinigt und die gemischten Kulturen zwei Minuten lang bei 17.900 × g zentrifugiert. Der Überstand wird abdekantiert und der Pellet in 30 Mikroliter frischem Medium resuspendiert. Anschließend wird die Suspension auf eine nährstoffreiche Agarplatte ohne Antibiotika aufgetragen und getrocknet, bis die Auftragestelle vollständig trocken ist.

Inkubieren Sie die Platte invertiert über Nacht bei einer Temperatur, die optimal für das Empfänger-Bakterium und gegebenenfalls zulässig für den Spender und den Helfer ist. Kratzen Sie nun die Stelle ab und streichen Sie zur Gewinnung einzelner Kolonien auf einer selektiven Antibiotikaplatte, um eine reine Kultur der Bakterienstrichprobe zu erhalten, und isolieren Sie eine einzelne Kolonie. Stellen Sie schließlich sicher, dass die entstandenen Kolonien das empfängliche Symbiont-Bakterium und nicht den Spenderstamm darstellen.

Durch die Überprüfung auf das Vorhandensein empfängerspezifischer Phänotypen. Beispielsweise können Cino abdi-Bakterien von E. coli durch einen Katalase-Test unterschieden werden, bei dem auf das Vorhandensein des Plasmids durch Bestätigung der Fluoreszenz unter der Wellenlänge, die dem fluoreszierenden Plasmidprotein entspricht, geprüft wird. Nach dem Übernachtwachstum des natürlichen bakteriellen Symbionten werden 600 Mikroliter der Bakterienkultur auf acht bis zehn 10-Millimeter-Lipid-Agarsekten verteilt und die Platten anschließend im Dunkeln ohne Feuchtigkeit bei 25 Grad Celsius inkubiert.

Nach zwei Tagen 5.000 infektiöse juvenile Nematoden in 500 Mikroliter Medium auf die Bakterienrasen geben. Nach einer Inkubation der Platten bei 25 Grad Celsius für weitere drei Tage 20 Mikroliter Wasser auf einen Objektträger geben. Anschließend mit einem sterilen Stäbchen eine kleine Menge Nematoden vom Bakterienrasen abkratzen.

Legen Sie den Stab ins Wasser, damit die Nematoden abschwimmen können. Untersuchen Sie diesen Objektträger unter geringer Vergrößerung. Wenn Eier und Weibchen sichtbar sind, fahren Sie fort; wenn die Weibchen Eier enthalten, geben Sie einige Milliliter Wasser auf die Oberfläche der Platten, schwenken Sie die Platten vorsichtig und gießen Sie das Wasser anschließend in ein 50-Milliliter-Konischgefäß.

Die Nematoden sollten sich von den Platten lösen und auf der Plattenoberfläche nicht mehr sichtbar sein. Lassen Sie die Nematoden auf den Boden des Reaktionsgefäßes sedimentieren, dann pipettieren Sie das überschüssige Wasser von der Oberseite des Reaktionsgefäßes ab und füllen es erneut mit sauberem Wasser. Nachdem die adulten Nematoden gesedimentiert sind und das überschüssige Wasser erneut abpipettiert wurde, füllen Sie die kegelförmigen Reaktionsgefäße mit Ei-Lösung.

Anschließend die Röhrchen durch vorsichtiges Umstülpen genau 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mischen. Unmittelbar nach dem Schütteln die kegelförmigen Röhrchen genau 10 Minuten lang bei 1.250 G und Raumtemperatur unter Verwendung der Bremse zentrifugieren. Danach das Überstandsvolumen schnell abgießen, den Pellet durch Pipettieren mit Ei-Lösung resuspendieren und das kegelförmige Röhrchen mit frischer Ei-Lösung auffüllen.

Mischen Sie die Ei-Suspension gründlich, indem Sie das Röhrchen drei bis fünf Mal umstülpen, und pelletieren Sie die Eier anschließend sofort sowie dekantieren Sie den Überstand, wie gerade gezeigt. Resuspendieren Sie das Pellet durch Pipettieren in Misogynie-Bouillon oder LB und überführen Sie die Ei-Suspension danach in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie nun das 15-Milliliter-Röhrchen mit LB, waschen Sie die Eier dreimal in der Bouillon unter Anwendung der gleichen schnellen Technik, die gerade demonstriert wurde, und verdünnen Sie die resuspendierten P-Nematoden-Eier anschließend auf mindestens 10 Eier pro Mikroliter.

Überführen Sie die Eier in eine sechs Zentimeter große Petrischale, die fünf Milliliter LB sowie Antibiotika gegen kolonisierende Bakterien enthält. Die Schale kann nach dem Übernachst-Wachstum und der Selektion der fluoreszierenden Bakterien bis zu vier Tage lang in Parafilm verpackt aufbewahrt werden. Verteilen Sie mit einem sterilen Stäbchen 600 Mikroliter der Bakterienkultur auf 10 Millimeter großen Lipid-Agarscheiben und inkubieren Sie die Kultur bei 25 Grad Celsius.

Nach zwei Tagen 500 bis 5.000 Nematoden-Eier auf jede Lipidplatte geben. Falls die Platte gelagert wurde, die Eier mindestens einmal mit 15 Milliliter LB wie zuvor gezeigt waschen, bevor die Eier auf die zuvor vorbereiteten Bakterienrasen aufgebracht werden. Anschließend die Nematoden-Bakterien-Kokulturen im Dunkeln ohne Feuchtigkeit bei 25 Grad Celsius inkubieren, bis infektiöse juvenile Stadien als unscharfer weißer Ring am Rand der Platte erscheinen.

Wenn die infektiösen juvenilen Stadien beobachtet wurden, entfernen Sie den Deckel der Lipid-Agar-Platte und stellen Sie den Boden der Platte in den Boden einer leeren 100 Millimeter mal 20 Millimeter großen Petrischale. Füllen Sie dann die Petrischale mit ausreichend Wasser, sodass das Wasser etwa bis zur halben Höhe der kleineren Platte ansteigt, und inkubieren Sie die Wasserfalle, bis die Nachkommen in Form infektiöser juveniler Stadien ins Wasser ausgeschwärmt sind.

Nachdem die Nematoden aus dem Wasser oder aus der gewünschten Entwicklungsstufe von dem entsprechenden Bakterienrasen gesammelt wurden, lösen Sie einige Körnchen Ole in 30 Mikrolitern Wasser auf und geben Sie ein bis zwei Mikroliter dieses Lähmungsmittels pro 50 Mikroliter Nematodenprobe hinzu. Überführen Sie anschließend etwa 20 bis 30 Mikroliter der gelähmten Nematodenprobe auf einen Objektträger und legen Sie ein Deckglas über die Probe. Untersuchen Sie die Nematoden mittels Lichtmikroskopie, um sicherzustellen, dass sich die Nematoden im Sichtfeld befinden.

Um die Lokalisation der Bakterien zu bestimmen, fotografieren Sie die Nematoden zusätzlich zur Lichtmikroskopie unter fluoreszenzmikroskopischen Bedingungen und überlagern Sie anschließend die Bilder. Es kann erforderlich sein, mehrere Vergrößerungen und Ansichten des Nematoden zu probieren, um die Bakterien zu finden.

Eine Population der Nematoden aus zwei Medien wurde gezählt und hinsichtlich der Besiedlung durch das bakterielle Symbiont bewertet. Für aussagekräftige Statistiken sollte man pro Probe mindestens 100 Nematoden zählen, wobei jeweils mindestens 30 in jede Kategorie fallen sollten, wie in der Tabelle dargestellt. Diese Nematoden sind bei Wachstum auf Lipid-Agar zu etwa 14,6 % und bei Wachstum auf Leber-Niere-Agar zu 68,6 % besiedelt.

Es wurde gezeigt, dass andere Nematoden- und Bakterienarten unterschiedliche Kolonisationsgrade aufweisen. Dieses Schema veranschaulicht das allgemeine Erscheinungsbild weiblicher Steiner NEMA. Die Einlage zeigt das Differentialinterferenzkontrastbild eines weiblichen S fot-Exemplars bei 20-facher Vergrößerung.

Der schwarze Pfeil in der Einlage zeigt die Vulva, während die weißen Pfeile sichtbare Eier anzeigen. Dieses Bild zeigt ein entwickeltes, aber nicht geschlüpftes Volt-Nematoden-Ei bei 40×-Vergrößerung, und diese aus s-Volta-Nematoden isolierten Eier wurden bei 10×-Vergrößerung abgebildet. Hier sind repräsentative Mikroskopaufnahmen von Steiner-Nima-Nematoden, die mit Xeno aptus-Bakterien assoziiert sind, in diesem ersten Bild dargestellt.

Die Nematoden von Alvin waren mit ihrem bakteriellen Symbionten expo assoziiert, der GFP exprimierte, um dieses Zusammengesetzte Bild zu erzeugen. Ein Phasenkontrastbild wurde mit einem Fluoreszenzbild überlagert. Der Pfeil zeigt die innerhalb des infektiösen juvenilen Nematoden vorhandenen Bakterien an.

Dieses Bild zeigt ein juveniles Nematodenexemplar von S. carpa capsi mit GFP-exprimierendem X. nla. Die Aufnahme wurde in ähnlicher Weise wie das vorherige Bild erstellt und zeigt das juvenile Nematod, bei dem mittels grünem fluoreszierendem Protein markierte Bakterien als grüne Stäbchen im gesamten intestinalen Lumen des Nematoden sichtbar sind. Zusätzlich zu dem beschriebenen Verfahren können andere Methoden, wie beispielsweise die genetische Manipulation des bakteriellen Symbionten vor der Assoziierung mit dem Nematodenwirt, integriert werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, etwa welche molekularen Mechanismen für die Wirt-Mikrobe-Assoziation notwendig sind.