Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray
21 de agosto de 2009
Se describe un nuevo método cuantitativo para la identificación de lipidómica numerosas especies de lípidos en la levadura con la encuesta de exploración de ionización electrospray espectrometría de masas (ESI / MS). Este método supera actualmente los métodos disponibles para la identificación y cuantificación de los lípidos en la capacidad de resolver diferentes formas moleculares de los lípidos, la sensibilidad y la velocidad.
Este protocolo permite analizar rápidamente los componentes principales del lípido de levadura. Comienza con la recolección y lavado de las células de levadura. Las células lavadas se colocan en una mezcla de cloroformo y metanol uno a dos, y se lisaron con perlas de vidrio.
La adición de cloroformo y agua separa las dos fases. Se recoge la fase orgánica, se seca y luego se disuelve la película lipídica en cloroformo para su almacenamiento antes de la espectrometría de masas. Los lípidos extraídos se diluyen en cloroformo y metanol con hidróxido de amonio, y se añade una mezcla de estándares internos.
La solución lipídica ya puede inyectarse directamente en el espectrómetro de masas. Hola, soy Simon Bork del laboratorio de Vladimir Teco en el Departamento de Biología de la Universidad Concordia. Hoy les mostraré un método para cuantificar lípidos de levadura utilizando espectrometría de masas.
Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los cambios en los lípidos de levadura bajo diferentes condiciones de crecimiento. Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, resuspenda los pellet de levadura previamente preparados y congelados en 1,6 mililitros de agua destilada fría con hielo, y transfiera 1,6 mililitros de la suspensión celular a tubos de centrífuga de vidrio de alta velocidad.
Téngase en cuenta que durante todo este procedimiento, todas las manipulaciones con lípidos extraídos se realizan utilizando pipetas o jeringas de vidrio. Dado que los plásticos generarán una señal de fondo elevada si entran en contacto con cloroformo, inicie la extracción de lípidos añadiendo seis mililitros de una mezcla de cloroformo y metanol en una proporción de uno a dos y 0,8 mililitros de perlas de vidrio medidos en un tubo einor a la suspensión celular. Los volúmenes exactos no son críticos siempre que se mantenga la proporción de uno a dos a 0,8 para cloroformo, metanol y levadura suspendida en agua. Agite en vórtex.
La suspensión celular y las perlas de vidrio se mezclan dos veces durante un minuto cada vez; a continuación, se añaden dos mililitros de cloroformo y se mezcla suavemente, luego se incuba durante cinco minutos a temperatura ambiente con mezclas ocasionales. Después de la incubación de cinco minutos, añada dos mililitros de agua destilada y mezcle suavemente. A continuación, incube nuevamente durante cinco minutos a temperatura ambiente con mezclas ocasionales.
Aquí también, es más importante mantener la proporción de dos a dos a 1,8 de cloroformo, metanol y agua, en lugar de un volumen específico. Cuando la segunda incubación haya finalizado, centrifugue durante cinco minutos a 3000 Gs a temperatura ambiente, recoja todo el sobrenadante de esta primera extracción en un nuevo tubo de centrífuga de vidrio de alta velocidad y agregue 3,2 mililitros de cloroformo a los pellet celulares restantes para una segunda extracción de lípidos.
Vortex las pastillas celulares con el cloroformo añadido dos veces durante un minuto cada vez. Luego, centrifugue durante cinco minutos a 3000 Gs a temperatura ambiente. Añada el sobrenadante de esta segunda extracción al sobrenadante recogido tras la primera extracción. A continuación, centrifugue los sobrenadantes recogidos durante cinco minutos.
A 3000 Gs a temperatura ambiente, los lípidos extraídos ahora están disueltos en la fase orgánica inferior. Deseche la fase acuosa superior y transfiera la fase inferior a un nuevo tubo de centrífuga de vidrio de alta velocidad. Para obtener espectros más limpios en el espectrómetro de masas, centrifugue la fase orgánica durante cinco minutos a 3000 Gs a temperatura ambiente y transfiera todo el sobrenadante a un vial de vidrio.
Seque las grasas disueltas con nitrógeno, disuelva la película lipídica seca en 500 microlitros de cloroformo y almacene a menos 20 grados Celsius hasta que esté listo para analizar las muestras mediante espectrometría de masas. Comience preparando una mezcla estándar de los lípidos en cloroformo según se indica en la tabla uno del protocolo escrito adjunto. Cada lípido representa una clase diferente.
Esta solución puede almacenarse a menos 20 grados Celsius para su uso posterior antes de la inyección de los lípidos extraídos en el espectrómetro de masas. Combine 10 microlitros de la muestra con 10 microlitros de la mezcla estándar de lípidos. Tenga en cuenta que la relación entre el estándar y la muestra puede modificarse según sea necesario.
Resuelva la muestra y la mezcla de lípidos patrón utilizando un espectrómetro de masas micro Q a F, equipado con una fuente de electroaspersión nano que opera a un caudal de un microlitro por minuto. Los ajustes se detallan en la tabla dos del protocolo escrito adjunto. Aunque el uso de la alta resolución de un espectrómetro de masas Q a F es ventajoso, no constituye un requisito obligatorio.
Los parámetros exactos del instrumento variarán entre espectrómetros de masas. Después de la adquisición de datos, se suavizan los espectros de masas, se resta el fondo y se centran los picos. Finalmente, exporte la lista de picos a Excel.
Luego, normalice los picos de cada vidrio lipídico a su estándar interno. Dependiendo de la aplicación, puede ser necesario realizar un procesamiento posterior adicional, como desisotopado y desconvolución. Este método permite la determinación rápida y profunda de los componentes principales del lipido de levadura do.
Aquí hemos resaltado un lípido, que ha sido desconvolucionado por desetiquetado isotópico y normalizado respecto a su estándar interno. Acabamos de mostrarle cómo aislar lípidos de levadura y cómo determinar el lípido de levadura mediante espectroscopía de masas con ionización por electrospray. Al realizar este procedimiento, es importante recordar evitar el uso de plásticos y mantener su muestra dentro del rango lineal de concentraciones.
Este método es bastante flexible y muchos de los volúmenes pueden modificarse según sea necesario. Este protocolo de extracción también es adecuado para otros métodos de análisis de lípidos, como la cromatografía en capa fina y la espectroscopía de masas multidimensional. Eso es todo.
Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este artículo presenta un nuevo método cuantitativo de lipidómica para identificar diversas especies lipídicas en levaduras mediante espectrometría de masas con ionización por electrospray en modo de análisis completo (ESI/MS). Este método mejora significativamente las técnicas existentes en cuanto a identificación, cuantificación, sensibilidad y velocidad de detección de lípidos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Lipidómica
- Espectrometría de masas
- Biología de levaduras
Antecedentes
- La lipidómica es fundamental para comprender las funciones celulares.
- Los métodos tradicionales de análisis de lípidos tienen limitaciones en sensibilidad y resolución.
- La espectrometría de masas con ionización por electrospray (ESI/MS) en modo de escaneo de reconocimiento ofrece una alternativa prometedora.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar la identificación y cuantificación de lípidos en levaduras.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rápido y eficiente para el análisis de lípidos.
- Mejorar la resolución en la identificación de especies lipídicas.
- Aumentar la sensibilidad en la cuantificación de lípidos.
Métodos Utilizados
- Recolección y lavado de células de levadura.
- Lisis de células mediante perlas de vidrio en una mezcla de cloroformo-metanol.
- Separación de fases lipídicas utilizando cloroformo y agua.
- Preparación de muestras lipídicas para análisis por espectrometría de masas.
Resultados principales
- El nuevo método permite la identificación de numerosas especies de lípidos.
- Demuestra una sensibilidad superior en comparación con las técnicas existentes.
- La velocidad del análisis se mejora significativamente.
Conclusiones
- Este método representa un avance significativo en la lipidómica.
- Puede aplicarse a diversas áreas de investigación que implican el análisis de lípidos.
- Estudios futuros podrían ampliar su aplicación a otros organismos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La lipidómica cuantitativa mediante espectrometría de masas con ionización por electrospray (ESI/MS) permite un perfilado rápido y de alta sensibilidad de los lipidomas de levaduras, apoyando la desactivación de mecanismos y la validación de objetivos en las fases iniciales del descubrimiento. Este flujo de trabajo acelera la identificación y cuantificación de lípidos, proporcionando datos sólidos para la interrogación de vías metabólicas y estudios funcionales. El enfoque es directamente relevante para equipos de biofármacos que buscan análisis lipidómicos escalables y reproducibles para orientar decisiones en etapas de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el perfilado completo de especies lipídicas para aclarar las vías metabólicas.
- Apoya la validación funcional de dianas relacionadas con lípidos en modelos de levadura genéticamente manipulables.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos mediante la cuantificación de cambios lipídicos bajo diferentes condiciones.
- Proporciona datos cuantitativos para orientar las decisiones de avance o interrupción en la selección de dianas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una cuantificación de lípidos validada y reproducible, adecuada para la estandarización de ensayos.
- Reduce el tiempo de preparación de muestras al eliminar los pasos de separación cromatográfica.
- Facilita la preparación para cribado de alto rendimiento mediante análisis rápido de muestras.
- Permite la comparación confiable de los efectos de compuestos sobre los perfiles lipídicos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con estudios lipidómicos relevantes para enfermedades al permitir el análisis de lípidos específico por orgánulos.
- Proporciona continuidad desde los hallazgos en modelos de levadura hasta sistemas eucariotas superiores.
- Apoya el avance ajustado al riesgo mediante la cuantificación de biomarcadores lipídicos.
- Mejora la confianza predictiva en la investigación traslacional de biología lipídica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de lipidómica por ESI/MS es adecuado desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos líderes, apoyando tanto flujos de trabajo basados en hipótesis como de cribado.
- Biología del Descubrimiento: Permite la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el perfilado cuantitativo de lípidos.
- Selección: Proporciona mediciones de lípidos reproducibles y listas para ensayos, para la evaluación de compuestos.
- Analítica: Genera resultados cuantitativos normalizados para comparaciones estadísticas robustas.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores y la continuidad preclínica al extender los hallazgos más allá de la levadura.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma flexible y escalable, adaptable a diversas necesidades de investigación lipidómica.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la biología de lípidos.
- Valor operativo: Optimiza los flujos de trabajo mediante un procesamiento y análisis de muestras rápido y estandarizado.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en la toma de decisiones y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de programas dirigidos a lípidos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en espectrometría de masas y protocolos de extracción de lípidos.
- Necesita acceso a instrumentación de espectrometría de masas de alta resolución y software analítico.
- Exige una estandarización rigurosa del manejo de muestras para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a otros sistemas modelo con optimización del protocolo.
- Debe evitarse el uso de material plástico para prevenir interferencias en la señal de fondo.
