La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas
31 de julio de 2011
Normas de isótopos estables y de captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables de espectrometría de masas (MRM-MS) para proporcionar una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. A continuación se describe el protocolo de uso de partículas magnéticas en un formato parcialmente automatizado.
El objetivo general del siguiente procedimiento es aislar y cuantificar péptidos en una mezcla compleja que actúan como sustitutos de sus respectivas proteínas. Primero, las proteínas grandes dentro de la mezcla se digieren en péptidos componentes utilizando una enzima como la tripsina. Luego, los analitos péptidos objetivo y un estándar interno marcado con isótopo estable agregado se enriquecen mediante anticuerpos antipéptidos, inmovilizados en partículas magnéticas codificadas con proteína G tras el aislamiento.
Los péptidos diana se eluyen a partir de las partículas magnéticas y se analizan mediante espectrometría de masas para cuantificarlos en relación con el estándar interno. Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos existentes como los inmunoensayos tradicionales son que es más rápida y más rentable al desarrollar un gran número de ensayos. Tiene una alta tasa de éxito y se puede multiplexar fácilmente, lo que demuestra que el procedimiento será detallado.
Un técnico en el laboratorio tiene un plasma de 10 microlitros en hielo húmedo. Transfiera la muestra a una placa de pocillos profundos de 1000 microlitros y cúbrala con película parafilm para desnaturalizar las proteínas con 20 microlitros de urea fresca 9 molar y 30 milimolar de DTT a cada muestra e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Añada tres microlitros de iodoacetamida fresca 500 milimolar a cada muestra e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Diluya ahora la urea hasta 0,6 molar con tris 100 milimolar pH 8, y añada 10 microlitros de una solución stock de tripsina de un microgramo por microlitro para obtener una relación enzima:sustrato de 1:50.
Después de incubar la reacción a 37 grados Celsius durante la noche, agregue tres microlitros de ácido fórmico puro hasta una concentración final del 1 % y continúe agregando el estándar de isótopo estable o múltiples estándares. Si se realiza un ensayo multiplex, lave bien la placa de cartuchos Oasis con 500 microlitros de ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo al 80 %, descartando el flujo filtrado. Luego, equilibre la placa de cartuchos agregando 500 microlitros de ácido fórmico al 0,1 % en agua y deseche el flujo filtrado.
Cargue las muestras de digestión en la placa de cartucho y ajuste el vacío para que el flujo sea muy lento. Lave tres veces con 500 microlitros de ácido fórmico al 0,1% en agua y deseche el flujo. Eluya los péptidos dos veces con 500 microlitros de ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo al 80%, luego liofilice o seque el eluato y reconstituya los péptidos secos en 50 microlitros de PBS más Chaps al 0,03%. Transfiera las muestras a una placa estándar Kingfisher de 96 pocillos, agregue un microgramo de anticuerpo y 1,5 microlitros de perlas magnéticas codificadas con proteína G por cada blanco. Vortexee las perlas antes de añadirlas.
Para asegurar que las perlas estén bien suspendidas. Cubra la placa con papel de aluminio e incube durante la noche con agitación suave en centrífuga. Coloque la placa a 400 RPM durante 10 segundos para eliminar cualquier líquido de la superficie del papel de aluminio.
Retire la cubierta de aluminio. La manipulación de la muestra se realiza en una plataforma kingfisher automatizada. Lave las perlas dos veces con 200 microlitros de PBS más 0.03% CHAPS y una vez con 200 microlitros de una dilución uno a diez de PBS más 0.03% CHAPS. Ahora, eluya los péptidos con 25 microlitros de ácido acético al 5% más 0.03% CHAPS.
Coloque la placa de elución sobre un imán y transfiera el eluato a una placa de 96 pocillos, teniendo cuidado de no transferir las perlas sobrantes. Cubra la placa con la lámina adhesiva, y lleve esta placa que contiene el eluato al espectrómetro de masas triple o cuádruple para su análisis. El método MRM se construye obteniendo un espectro de masas en tándem del péptido de interés y luego seleccionando y optimizando los mejores iones fragmento de transición.
Normalmente, una configuración para el análisis MRM utiliza columnas de captura y analítica C 18 con dos fases móviles. Cargue 10 microlitros de la muestra y eluya mediante un gradiente lineal. Integre las áreas de los picos para los péptidos ligeros y pesados, y calcule la relación del área del pico del péptido no marcado respecto al marcado en cada muestra.
Los péptidos ligeros y pesados eluyen al mismo tiempo y se pueden monitorear múltiples transiciones para cada péptido. Para confirmar la identidad, se mide el área del pico del péptido endógeno en relación con el área del estándar interno para obtener una medida cuantitativa del péptido diana. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implementar esta técnica en su laboratorio. Puede utilizarse para cuantificar cualquier proteína de interés, lo que la hace adecuada para una amplia gama de aplicaciones en la investigación biológica.
Resumen
Este artículo describe la técnica de Estándares de Isótopos Estables y Captura mediante Anticuerpos Anti-Péptidos (SISCAPA), que combina el enriquecimiento por afinidad de péptidos con espectrometría de masas con dilución de isótopos estables para la medición cuantitativa de péptidos. El protocolo utiliza partículas magnéticas en un formato parcialmente automatizado para aumentar la eficiencia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Espectrometría de masas
Antecedentes
- SISCAPA permite la cuantificación de péptidos como sustitutos de proteínas.
- El método mejora los ensayos inmunológicos tradicionales en rapidez y rentabilidad.
- Es adecuado para ensayos multiplex, lo que permite el análisis simultáneo de múltiples péptidos.
- La técnica implica la digestión de proteínas en péptidos y su enriquecimiento mediante anticuerpos específicos.
Objetivo del estudio
- Aislar y cuantificar péptidos a partir de mezclas complejas.
- Mostrar un protocolo que mejore la eficiencia del análisis de péptidos.
- Proporcionar un método que pueda aplicarse ampliamente en la investigación biológica.
Métodos Utilizados
- Digestión de proteínas mediante tripsina para generar péptidos.
- Enriquecimiento de péptidos diana con anticuerpos antipéptidos en partículas magnéticas.
- Análisis por espectrometría de masas para la cuantificación de péptidos.
- Implementación de un flujo de trabajo parcialmente automatizado utilizando la plataforma Kingfisher.
Resultados principales
- El método SISCAPA proporciona una alta tasa de éxito para la cuantificación de péptidos.
- Demuestra la capacidad de multiplexar ensayos de manera eficaz.
- Las mediciones cuantitativas se logran comparando las relaciones entre péptidos ligeros y pesados.
- La técnica es adaptable para diversas proteínas de interés.
Conclusiones
- SISCAPA es un método robusto para la cuantificación de péptidos en muestras biológicas.
- El protocolo puede implementarse en laboratorios para diversas aplicaciones.
- Ofrece ventajas frente a los métodos tradicionales, lo que lo convierte en una herramienta valiosa en la investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición cuantitativa de proteínas sigue siendo un cuello de botella crítico en la validación de dianas y el descubrimiento de biomarcadores, donde los inmunoensayos tradicionales presentan limitaciones de costo, tiempo de espera y interferencias. SISCAPA ofrece una alternativa escalable y multiplexable que mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar una cuantificación estequiométrica e independiente de anticuerpos de péptidos proteotípicos. Esto respalda decisiones de cartera ajustadas al riesgo y la continuidad traslacional desde la hipótesis hasta los modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación precisa de proteínas diana en matrices complejas.
- Valor operativo: Reduce la ambigüedad mecanicista al utilizar péptidos proteotípicos como sustitutos estequiométricos de la concentración proteica.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al proporcionar datos reproducibles y multiplexables para la priorización de objetivos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera protocolos validados de enriquecimiento de péptidos compatibles con la cuantificación por SRM/MRM-MS posterior.
- Valor operativo: Permite la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante estándares internos de isótopos estables y enriquecimiento con perlas magnéticas.
- Escalabilidad: Facilita el desarrollo de ensayos multiplexados para la evaluación paralela de objetivos sin agotamiento del plasma.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los flujos de trabajo de descubrimiento y preclínicos al proporcionar lecturas cuantitativas de péptidos que se pueden trasladar entre diferentes tipos de muestras.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Permite la alineación de biomarcadores mediante la detección específica y resistente a interferencias de péptidos en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Confianza Predictiva: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la medición cuantitativa de proteínas sin necesidad de anticuerpos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
SISCAPA se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del objetivo hasta la identificación de compuestos activos, permitiendo la medición cuantitativa de proteínas como base para el desarrollo de ensayos y campañas de cribado.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar proteínas diana en contextos biológicos nativos.
- Selección: Ofrece listo para ensayos mediante enriquecimiento reproducible de péptidos y lecturas cuantitativas por espectrometría de masas para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Proporciona relaciones de áreas bajo las curvas de picos de péptidos ligeros/pesados como resultados cuantitativos para comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la cuantificación estandarizada de péptidos.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para la cuantificación multiplexada de objetivos en diversos proyectos y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo y decisiones de avance.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en proteómica, enriquecimiento basado en anticuerpos y espectrometría de masas.
- Depende del acceso a espectrómetros de masas con capacidad SRM/MRM y plataformas para el manejo de perlas magnéticas.
- Necesita estandarización entre equipos de los criterios de validación de anticuerpos y selección de péptidos.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos de muestras, incluyendo plasma, lisados celulares y extractos de tejidos.
- Incluye limitaciones prácticas relacionadas con la disponibilidad de anticuerpos para péptidos específicos y la eficiencia de la digestión con tripsina.
