Microarrays de ADN: Control de calidad de la muestra, la hibridación de la matriz y de escaneo

El objetivo general de este procedimiento es realizar un experimento de microarreglo utilizando un aparato mezclador automatizado. Esto se logra primero analizando la calidad de las muestras de ARN con el bioanalizador, posteriormente a la amplificación y etiquetado del ARN. Las muestras de ARN se hibridan con los microarreglos.

Finalmente, las micromatrices hibridadas se lavan y escanean. En última instancia, se obtienen resultados que muestran la expresión diferencial de transcritos de ARN mediante el análisis de imágenes de micromatrices de fluorescencia de doble color. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de hibridación de micromatrices son difíciles de aprender debido al equipo especializado.

El análisis de control de calidad comienza con la preparación del instrumento bioanalizador 2,100 y de la estación de cebado del chip según se indica en el procedimiento escrito. A continuación, la matriz de gel se filtra pipeteando 550 microlitros en un filtro de centrifugación proporcionado con el kit RNA 6,000 nano. Se filtra a 1,500 RCF durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Luego, alícuote el gel filtrado en alícuotas de 65 microlitros, que pueden almacenarse a cuatro grados Celsius durante hasta un mes. Vortexe el concentrado de colorante durante 10 segundos y añada un microlitro a una alícuota de 65 microlitros. Después de vortexar la mezcla, centrifugue el gel filtrado a 13.000 RCF durante 10 minutos a temperatura ambiente para correr las muestras.

Primero, coloque un chip en la estación de cebado. En esta demostración, se utilizan chips RNA 6,000 nano. Cargue nueve microlitros de la mezcla de gel y tinte en el pocillo marcado con una G blanca sobre fondo negro.

Con la punta de la pipeta colocada en la parte inferior del pocillo. Coloque el émbolo de la jeringa en un mililitro y cierre la estación de cebado. Presione el émbolo lentamente pero de forma constante hasta que quede sujetado por la pinza.

Después de 30 segundos, suelte el clip y permita que el émbolo suba durante unos segundos. Una vez que el émbolo se detenga, tire del émbolo hacia atrás hasta la posición de un mililitro y abra la estación de cebado. Cargue nueve microlitros del colorante para geles.

Mezcle en cada uno de los dos pocillos. A continuación, agregue cinco microlitros del marcador en el pocillo del marcador y en cada uno de los 12 pocillos de muestra. Luego, cargue un microlitro de la escalera desnaturalizada en el pocillo del marcador y un microlitro de cada muestra desnaturalizada en los pocillos de muestra.

Finalmente, agregue un microlitro del marcador a cada muestra no utilizada. Una vez cargado el pocillo, vortexee el chip durante un minuto a 2.400 RPM. Después de iniciar el software 2.100 expert, coloque el chip y cierre la tapa.

Asegúrese de que se ha seleccionado el puerto correcto y realice el ensayo dentro de los cinco minutos posteriores a la carga de las muestras para evitar la evaporación. Los métodos para realizar la amplificación y etiquetado de ARN se encuentran en el protocolo escrito. Una vez etiquetado, purifique el ARNc para eliminar cualquier nucleótido no incorporado. Utilizando columnas mini fáciles de Cogens, el ARNc etiquetado luego puede cuantificarse con un espectrofotómetro NanoDrop 2000.

En el modo de medición de microarreglos, registre la concentración de la muestra, el rendimiento y la actividad específica. Para la hibridación de microarreglos, es necesario alcanzar un rendimiento de al menos 825 nanogramos y una actividad específica de al menos ocho picomoles por microgramo al menos dos horas antes de la hibridación del microarreglo. Encienda la estación de hibridación y ajústela a 65 grados Celsius.

Este protocolo describe el uso de matrices Agilent cuatro por 40 de 4K con el sistema de hibridación Roche nimble gen y una cámara de mezclado cuádruple posterior a la fragmentación de CRNA realizada según se describe en el protocolo escrito, prepare la cámara de hibridación. Coloque una portaobjetos con microarreglo en la herramienta de montaje y desmontaje con el lado del código de barras hacia arriba. Primero abra un mezclador A cuatro y exponga el adhesivo que sujeta la matriz y la herramienta de montaje y desmontaje para evitar cualquier movimiento.

Coloque el mezclador A cuatro en el portaobjetos comenzando por el extremo opuesto. Asegúrese de que esté correctamente alineado con la herramienta y adhiera el mezclador a lo largo del arreglo. Deslice hacia afuera desde el extremo del mezclador para retirar el conjunto del mezclador y el portaobjetos.

Utilice la herramienta de alisado para presionar a lo largo de toda la junta adhesiva y asegurarse de que esté firmemente pegada al portaobjetos. Pueden observarse pequeñas burbujas de aire atrapadas entre el adhesivo y el portaobjetos sobre el fondo oscuro. Dedique tiempo adicional a eliminar estas burbujas con la herramienta de alisado.

El arreglo ya está listo para cargarse. Utilice una pipeta de desplazamiento positivo para cargar 100 microlitros de la muestra de hibridación. Introduzca firmemente la punta dentro del orificio y dispense lentamente y de forma uniforme para que no quede aire atrapado en el área del arreglo.

Cuando la muestra cubra toda la matriz y el líquido comience a salir rápidamente por el puerto de ventilación, retire únicamente el pipeteo soltando el émbolo. Una vez que la punta esté alejada del portaobjetos, absorba suavemente el exceso de líquido en ambos puertos, teniendo cuidado de no extraer la muestra de la cámara misma. Luego, cubra los orificios con adhesivos utilizando pinzas.

Coloque la laminilla en la estación de hibridación y verifique que los orificios de las vejigas estén correctamente posicionados sobre los anillos O. Esto garantizará una mezcla adecuada durante la hibridación. Cierre la tapa de la laminilla y la tapa de la estación.

Configure la estación en modo de mezcla B e hibride el microarreglo a 65 grados Celsius durante 17 horas. Una vez finalizado, llene un recipiente de vidrio etiquetado como A con tampón de lavado uno; el recipiente debe ser lo suficientemente grande como para contener la herramienta de ensamblaje y desensamblaje y permitir cierto movimiento. Todos los lavados deben realizarse en material de vidrio, ya que el plástico tiende a liberar compuestos que resultan en un fondo elevado en el microarreglo.

Coloque un portaobjetos y una barra de agitación en un recipiente de tinción. Etiquetado como B, llene el recipiente con tampón de lavado hasta cubrir el portaobjetos y coloque el recipiente sobre una placa de agitación a temperatura ambiente. Además, agregue una barra de agitación en un recipiente de tinción vacío etiquetado como C y colóquelo sobre una placa de agitación.

Retire el matriz de la estación de hibridación y colóquelo en la herramienta de montaje y desmontaje. Sumerja todo el conjunto en el recipiente mientras sostiene la herramienta de montaje y desmontaje y la placa desde lados opuestos con una mano. Retire cuidadosamente el mezclador A cuatro sin rayar el área del matriz.

Coloque rápidamente la portaobjetos en el porta y el recipiente de tinción B. Se debe minimizar la exposición al aire, ya que el colorante SCI five es sensible al ozono. Lave la borrado durante un minuto agitando a velocidad media. Llene el recipiente de tinción C con tampón de lavado precalentado dos.

Transfiera los portaobjetos y lávelos durante un minuto. Después del lavado, retire muy lentamente el bastidor de portaobjetos del recipiente de tinción C para minimizar las gotas que quedan en el portaobjeto. Seque el portaobjeto centrifugándolo durante dos minutos.

Luego coloque el portaobjetos en un tubo cónico de 50 mililitros y llénelo inmediatamente con gas argón usando el escáner gene picks 4,000 B de molecular devices para evitar la pérdida de señal mostrada. A continuación se muestran ejemplos de cuatro muestras de ARN aisladas del cerebro humano. La calidad de la muestra de tejido tumoral se evaluó utilizando el bioanalizador 2,100 con un chip RNA 6,000.

Las flechas sólidas y abiertas indican la posición de las especies de ARN 18 s y 28 S-R-R-N-A, respectivamente. El número de integridad del ARN o RIN es una medida cuantitativa de la calidad del ARN; muestras de ARN total de buena calidad deben producir solo dos picos principales al ser analizadas en un bioanalizador para control de calidad, correspondientes a las dos especies principales de ARN ribosómico.

Alguna degradación del ARN aparecerá como una mancha difusa antes del primer pico de ARN ribosómico y un pico significativamente más bajo para el ARN 28 S-R-R-N-A severamente degradado. El ARN de baja calidad mostrará un pico amplio o una serie de picos a tiempos de retención bajos. Mientras que los dos picos de ARN ribosómico tendrán una intensidad muy baja o no serán identificables en absoluto.

Las matrices de buena calidad deben producir una señal alta a valores relativamente bajos del PMT. Se espera que la mayoría de los transcritos estén presentes a niveles similares en la muestra experimental y en la muestra de referencia. Los cambios generalizados y masivos en la expresión génica probablemente carezcan de significado biológico.

Por lo tanto, la mayor parte de la matriz debería verse amarilla en lugar de verde o roja. Las señales de buena calidad también deben estar en un rango dinámico tal que los histogramas de señal se superpongan completamente, como se observa en el diagrama de dispersión de la imagen de la matriz. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento de microarreglo utilizando un aparato automatizado de hibridación.