Micro-Mecánica Caracterización del tejido pulmonar con microscopía de fuerza atómica

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar el entorno mecánico local del parénquima pulmonar a una escala espacial relevante para las células residentes, mediante la medición directa de las propiedades elásticas locales de tejido pulmonar fresco mediante microindentación con microscopía de fuerza atómica. Esto se logra cortando el tejido pulmonar de ratón inflado con agarro con una cuchilla de afeitar o bisturí, para preparar tiras de parénquima pulmonar de cinco por cinco milímetros de largo y ancho, y 400 micrómetros de grosor. A continuación, las tiras de tejido pulmonar no fijadas y no permeabilizadas se tiñen mediante inmunotinción, lo que identifica áreas de interés para la microindentación con MF.

Luego se realiza una microindentación con FM en tiras de tejido en PBS a temperatura ambiente. Con el fin de medir directamente las propiedades elásticas locales del tejido pulmonar fresco, se obtienen resultados que muestran diferencias notables en el rango y la distribución de la rigidez del tejido en el parénquima pulmonar normal y fibrotico, así como grandes variaciones espaciales en la rigidez, particularmente dentro de la muestra de pulmón fibrotico.

Basado en mapas de rigidez extraídos de curvas de desplazamiento forzado obtenidas mediante microindentación con microscopio de fuerza. La principal ventaja de esta técnica frente a medidas existentes, como el estiramiento de tiras de tejido, es que ofrece una resolución espacial sin precedentes, proporcionando una perspectiva única sobre la variación a escala microscópica en la rigidez del tejido. Esta medida puede ayudar a responder preguntas clave, como cómo varía espacialmente la rigidez dentro del tejido y cuál es el alcance y la escala espacial de los cambios de rigidez en la enfermedad.

Los procesos que resultan en la remodelación del tejido Para preparar tiras de tejido pulmonar, comience por estabilizar la estructura del pulmón para el corte, inflando pulmones de ratón aislados. Intratraquealmente con 50 mililitros por kilogramo de peso corporal de agar al 2% de bajo punto de gel, preparado en PBS. Amarre la tráquea y enfríe los pulmones inflados en un baño de PBS a cuatro grados Celsius durante 60 minutos. El agar se gelificará y endurecerá en los espacios aéreos, estabilizando suavemente la estructura pulmonar. Durante este intervalo, utilizando una navaja o bisturí, corte el tejido pulmonar de ratón estabilizado con agar en tiras de aproximadamente cinco por cinco milímetros de largo y ancho, y 400 micrómetros de espesor.

Luego, lave las tiras en PBS a 37 grados Celsius durante cinco minutos para eliminar restos de aros y excluir vías aéreas grandes y vasos. Corte tiras de regiones subpleurales alejadas de los bronquios principales si se van a imaginar vías aéreas y vasos grandes; corte tiras del tejido pulmonar más próximo a los bronquios principales para aislar áreas de interés para una microindentación por FM. Visualice el tejido mediante microscopía de contraste de fases o inmunotinción y visualice mediante microscopía de fluorescencia.

Consulte la parte escrita de este protocolo para conocer el procedimiento. Inmediatamente antes de una caracterización por microscopía de fluorescencia (FM), sujete las tiras de tejido a laminillas de 15 milímetros recubiertas con poli-L-lisina elevando la laminilla desde debajo del tejido flotante, asegurándose de que la tira de tejido se extienda uniformemente sobre la superficie de la laminilla. Si es necesario, coloque la tira entre dos laminillas limpias sin recubrir y aplique una presión suave para ayudar a la fijación del tejido a la laminilla recubierta con poli-L-lisina.

Calibre el sistema de FM-A siguiendo las instrucciones del fabricante inmediatamente antes de cada serie de experimentos de microindentación. Para ello, determine dos parámetros críticos: la constante del resorte del cantiléver mediante el método de fluctuación térmica en aire y la sensibilidad de deflexión del cantiléver, que es un parámetro utilizado para escalar la señal de salida del fotodiodo a la distancia real de deflexión del cantiléver.

Calibre la sensibilidad de deflexión obteniendo una curva estándar de desplazamiento forzado en PBS sobre un portaobjetos limpio. Luego, calcule la pendiente de la curva de desplazamiento forzado en la medición de la curva de desplazamiento forzado. La punta de MF se extiende hacia y se retrae de la superficie de la muestra en una ubicación única, monitorizando la deflexión del micromuelle delta D como función del desplazamiento de la punta delta Z. Se recomienda utilizar un micromuelle triangular de nitruro de silicio con una punta esférica de borosilicato de cinco micrómetros de diámetro, empleando sondas de MF con una constante elástica de 0,06 newtons por metro.

Hemos caracterizado mecánicamente materiales blandos con módulo de cizalladura que abarca de 100 a 50.000 pascales. Limpie la superficie inferior del portaobjetos de la muestra con papel de tejido, luego fíjelo a un portaobjetos de vidrio estándar con grasa al vacío. Monte el portaobjetos de vidrio en la platina de muestra de AFM y cubra el papel de tejido con 500 microlitros de PBS a temperatura ambiente.

Luego coloque una cabeza de exploración de FM sobre la muestra. Ajuste el portaobjetos del microscopio para configurar el microscopio para la observación mediante el ocular y alinear la punta de FM en el centro del campo de visión. Mueva el portaobjetos de FM para seleccionar un área de interés en el tejido.

Luego cambie a la visualización con cámara CCD para grabar la imagen de contraste de fases y/o imágenes de fluorescencia del tejido según se desee. Mueva lentamente la punta de microscopía de fuerza atómica (AFM) hacia abajo hasta que esté en contacto preciso con la muestra. La caracterización por microindentación con AFM de muestras blandas requiere pequeñas profundidades de indentación para evitar grandes deformaciones locales, lo que invalidaría el modelo de Hertz utilizado para el cálculo del módulo elástico. Para evitar grandes deformaciones, realice la indentación en modo de disparo (trigger) ajustando la desviación máxima del cantiléver a 500 nanómetros.

Este límite de desviación restringirá la fuerza máxima de indentación a menos de 30 nanonewtons. La velocidad de indentación debe seleccionarse lo suficientemente lenta como para explorar las propiedades elásticas en lugar de las propiedades viscoelásticas de la muestra blanda. Seleccione un rango de velocidad de dos a 20 micrómetros por segundo para el tejido pulmonar para una única medición desde un área de interés.

Mueva la sonda A FM a la ubicación de interés y realice una sola indentación para recopilar una curva estándar de fuerza-desplazamiento. La sonda se moverá únicamente en la dirección Z. Para la cartografía automatizada de una región de interés, cambie al modo de mapa de fuerza, seleccione el tamaño de escaneo y los puntos de muestreo dentro del área seleccionada.

La punta de AFM se desplaza sobre la superficie de la muestra entre los movimientos de indentación y recopila curvas individuales de fuerza-desplazamiento en cada punto dentro de una cuadrícula de muestra definida. Resultó práctico utilizar una cuadrícula de muestra de 16 por 16 para mapear un área de 80 micrómetros por 80 micrómetros a una velocidad de indentación de 20 micrómetros por segundo, lo cual puede completarse en aproximadamente 10 minutos. Para calcular el módulo de Young, ajuste la curva de fuerza-desplazamiento al modelo de indentación esférica de Hertz mediante un ajuste no lineal de curvas de mínimos cuadrados, como se muestra aquí, donde F equivale a K sub C multiplicado por delta D, siendo la fuerza necesaria para flexionar el cantiléver.

K sub C es la constante elástica del resorte del cantiléver. R es el radio de la punta esférica, delta igual a delta Z menos delta D es la indentación, y nu es la relación de Poisson de la muestra, que equivale a 0,4 para el tejido pulmonar. Para evaluar la calidad del ajuste, calcule el valor SSR, o suma de cuadrados de las diferencias entre los datos y los valores ajustados durante el ajuste no lineal de la curva.

Elimine mediciones poco fiables o ininteligibles descartando datos de curvas defectuosas con valores grandes de SSR. Si se desea, convierta el módulo elástico o E en módulo de cizalladura G, utilizando la relación E igual a dos veces la suma de uno más ν multiplicado por G. Para visualizar los patrones espaciales de rigidez recopilados en modo de mapa de fuerza, represente gráficamente los datos del módulo y mapas de contorno, por ejemplo, en una cuadrícula de 16 por 16 que cubra un área de 80 micrómetros por 80 micrómetros.

Para procesar una gran cantidad de datos de curvas de fuerza, se puede escribir un algoritmo personalizado para ajustar automáticamente las curvas de fuerza-desplazamiento, extraer módulos y/o trazar mapas de contorno o injertos ELA. Utilizando los mismos procedimientos y parámetros descritos anteriormente, esta figura muestra que el tejido fue correctamente cortado y teñido. La microarquitectura alveolar del parénquima pulmonar se conserva adecuadamente, como se observa mediante tinción de inmunofluorescencia del componente de la membrana basal, laminina, sin fijación ni permeabilización.

Estos paneles muestran la tinción de inmunofluorescencia para colágeno, una en pulmones frescos no fijados obtenidos de ratones previamente tratados con PBS o con bleomicina para inducir fibrosis. Aquí se muestran gráficos de fuerza-desplazamiento obtenidos mediante microindentación FM con la misma fuerza aplicada. La punta de FM genera una gran indentación en una región blanda, lo que resulta en una curva de fuerza-desplazamiento relativamente plana mostrada en azul, frente a una pequeña indentación y una curva de fuerza-desplazamiento empinada para una región más rígida mostrada en rojo.

Para obtener curvas de fuerza limpias tras cada indentación, es necesario retirar completamente la punta de microscopía de fuerza atómica (AFM) de la superficie de la muestra y asegurar que no haya contacto antes de la siguiente indentación. Este estado libre de contacto corresponde a la región plana de la curva, donde la punta se desplaza sin desviación del cantiléver. Esta figura muestra una curva típica errónea sin región plana, que ocurre cuando la punta no se retira completamente de la superficie de la muestra, como cuando una muestra blanda se adhiere a la punta, haciendo imposible determinar el punto de contacto si la punta queda completamente atrapada en la muestra blanda.

La curva puede tener este aspecto sin una desviación clara, pero con un pequeño ruido. Esta figura muestra la rigidez. Los datos extraídos de las curvas de desplazamiento forzado se muestran espacialmente como mapas de rigidez denominados injerto ELAs, donde la escala de colores varía según la rigidez. El injerto ELAs demuestra diferencias notables en el rango y la distribución de la rigidez del tejido en el parénquima pulmonar normal y fibrotico, así como grandes variaciones espaciales en la rigidez, particularmente dentro de la muestra pulmonar fibrotica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar el entorno mecánico local del parénquima pulmonar mediante la medición directa de las propiedades elásticas locales de tejido pulmonar fresco utilizando microscopía de fuerza atómica.