Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el
20 de julio de 2012
Este documento detalla cómo usar cámaras de flujo continuo de hipoxia para generar atmósferas con concentraciones definidas de O 2 Entender las respuestas biológicas a la disminución de O 2. Este sistema es fácil de instalar y mantener, y lo suficientemente flexible como para adaptarse a una amplia gama de O 2 Concentraciones y sistemas modelo
El objetivo del siguiente experimento es configurar y mantener una cámara de hipoxia utilizando un método de flujo continuo. Esto se logra obteniendo y fabricando los tubos, matraces y cámaras necesarios para el procedimiento. Como segundo paso, conecte el tanque de oxígeno y seleccione el caudal para crear el nivel deseado de hipoxia.
Hidrate el gas haciendo pasar el flujo a través de un frasco de burbujas lleno con agua desionizada. Conecte el gas hidratado a la cámara de hipoxia y coloque las muestras de prueba dentro de la cámara para exponerlas a condiciones hipóxicas. Se obtienen resultados que muestran letalidad embrionaria dependiente de Hi F1 en hipoxia, basados en la observación de la viabilidad hasta la edad adulta.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como las cajas de guantes, es que es fácil y económica de fabricar en el laboratorio y proporciona una concentración precisa y reproducible de gases en la cámara ambiental. Aunque este método ofrece información sobre la respuesta hipóxica en el nematodo C. elegans, también puede adaptarse a otros sistemas, incluyendo organismos modelo más grandes y cultivos celulares. Además, puede utilizarse para estudiar otros gases, como el dióxido de carbono y el sulfuro de hidrógeno.
Este protocolo demuestra cómo construir una cámara de hipoxia. El gas se almacena en tanques de gas comprimido con concentraciones de oxígeno definidas, y se conecta un regulador de dos etapas. El gas entra por la parte inferior del tubo de flujo y sale por la parte superior a la velocidad de flujo correcta.
Luego, el gas fluye hacia el frasco de burbujas, humedeciéndose. El gas hidratado pasa entonces a la cámara de hipoxia a través de la válvula de entrada, exponiendo las muestras a condiciones de hipoxia. Finalmente, el gas se libera al ambiente a través de un orificio de escape perforado en la cámara.
Puede utilizarse un recipiente de cristalización de Pyrex o una caja de flechas como cuerpo de la cámara ambiental. El volumen del recipiente debe mantenerse al mínimo y el material debe ser impermeable al gas. Taladre un orificio en un lado del recipiente con una broca de punta de carbono o diamante y coloque una conexión de barba de plástico.
Mezcle el epoxi antes de aplicarlo a la caja y al accesorio. Luego repita el mismo procedimiento en el lado opuesto del recipiente con el segundo orificio desplazado respecto al primero. Para aumentar la mezcla turbulenta, utilice un tubo de un octavo de pulgada de diámetro exterior, de FEP o nylon, para conectar los tanques de gas comprimido a un dispositivo de control de flujo, como un controlador de flujo másico o un medidor de rotor.
Los tanques de gas deben tener concentraciones de oxígeno definidas, equilibradas con nitrógeno, que cumplan con un estándar certificado para el contenido de oxígeno o para condiciones anóxicas. Para el uso de nitrógeno puro, emplee un regulador de dos etapas con la segunda etapa ajustada a la presión deseada. Consulte las instrucciones en el protocolo escrito para seleccionar un caudal adecuado.
Luego conecte el tubo desde el regulador de dos etapas al tubo de flujo que controla la velocidad de flujo del gas que entra en la cámara. Las salidas del tubo de flujo están conectadas a una botella de lavado de gases con cilindro fritado que contiene agua destilada. Luego conecte el tubo en el otro lado de la botella de lavado a uno de los accesorios de la cámara ambiental.
Esto hidratará el gas que entra en la cámara ambiental. Utilice grasa al vacío para sellar la cámara. Luego, coloque pesos sobre la tapa de la cámara para garantizar un sello hermético al aire.
Compruebe el sellado sosteniendo una pequeña cantidad de agua en la palma de una mano con guante frente al accesorio de escape de gas en la cámara y verifique la presencia de burbujas. Primero, genere poblaciones sincronizadas de Elgan marino. Coloque de uno a cien adultos GR en una gota de solución de lejía alcalina sobre la superficie de una placa de medio de crecimiento para nematodos sin siembra.
Deje que la solución de lejía se absorba en la placa tras un período de incubación de al menos ocho horas. Transfiera las larvas L1 sincronizadas a una placa sembrada con bacterias OP50 vivas. Alternativamente, permita que los adultos GRA depositen huevos en la placa durante dos o tres horas para generar un grupo de gusanos que se desarrollarán de forma sincrónica, o seleccione larvas L4 de una población mixta para recoger embriones jóvenes.
En el estadio de dos a cuatro células, utilice una cuchilla de afeitar para cortar los adultos de GR en un pequeño volumen de agua y luego transfiera los embriones mediante pipeta de boca antes de trasladar los gusanos a la placa para su exposición a condiciones hipóxicas. Coloque un anillo de ácido palmítico al 10 miligramos por mililitro en etanol alrededor del borde de las placas. Para evitar que los gusanos escapen de la superficie del medio de agar.
El ácido palmítico saldrá de la solución. A medida que el etanol se evapora, formando una barrera física para asegurar la uniformidad, asegúrese de reemplazar el agua en el frasco lavador de gases antes de la exposición en la cámara ambiental. Después de transferir los gusanos a las placas, selle las placas en la cámara ambiental, inicie el flujo de gas y mantenga la exposición durante el tiempo deseado para el ensayo.
Para evaluar la viabilidad de los embriones hasta la edad adulta, permita que los gusanos se desarrollen durante 48 horas después del regreso al aire ambiente, momento en el cual deberían encontrarse en estadio larval cuarto o como adultos de un día. Registre la viabilidad hasta la edad adulta en estos estadios. Para visualizar los gusanos tras la exposición hipóxica, transfiera los gusanos a una gota de medio M nueve sobre un cubreobjetos cuadrado de 22 milímetros e inviértalo sobre una almohadilla de agar al 2 % en medio M nueve, si es necesario.
Se pueden utilizar 25 milimolar de amol o 10 milimolar de azida de sodio como anestésico. Alternativamente, tras la exposición a hipoxia, la cámara ambiental transparente puede colocarse directamente sobre la platina de un microscopio estereoscópico. Se muestran dos vistas, una de ellas incluyendo todo el sistema de flujo de gas.
Otro con solo la cámara sobre la platina del microscopio. Cultive gusanos Bristol N2 en cuatro placas de crecimiento de 10 centímetros de diámetro hasta que la mayoría de los gusanos sean adultos GR. Lave los gusanos hacia un tubo cónico de 15 mililitros con una solución de hipoclorito alcalino en una proporción de 1 a 5 e incube con rotación hasta que los gusanos comiencen a disolverse.
No más de cinco minutos. Lave los gusanos tres veces con M nueve, centrifugando a 1.500 ×g entre cada lavado, sin romper la placa. Coloque los embriones blanqueados en 8 placas NGM de 150 milímetros y permita que los embriones se desarrollen hasta larvas L4 durante aproximadamente 48 horas.
A 22 grados Celsius, traslade las placas a la cámara ambiental y expóngalas a condiciones hipóxicas y anóxicas durante cuatro horas o durante el tiempo especificado por el diseño experimental. Para recolectar las muestras, retire rápidamente la tapa de la cámara hipóxica. Tome una placa de muestra, vuelva a sellar la cámara, anote el tiempo y registre los pasos.
Después de retirar los gusanos de la hipoxia, todo este proceso debe tardar menos de dos minutos. Utilice agua destilada para lavar los gusanos hacia un filtro de nailon y luego viértalos en un tubo cónico de 15 mililitros etiquetado que contenga 100 microlitros de SDS al 1 % y centrifugue. Los gusanos en SDS se centrifugan en una centrífuga de escritorio a 1 500 veces G durante 15 a 20 segundos.
Con una pausa, utilice un vacío para eliminar la mayor parte del sobrenadante del tubo, dejando intacto el botón de gusanos. Mediante una pipeta, transfiera el botón de gusanos con un volumen predeterminado de líquido a un tubo microfuga de 1,5 mL etiquetado. Si la muestra va a utilizarse para electroforesis SDS-PAGE, este tubo puede contener un volumen igual de tampón de carga proteica al doble de concentración; cierre el tubo y sumérjalo en nitrógeno líquido.
Repita hasta que todas las muestras hayan sido aisladas. Siga estos procedimientos para las muestras de control de aire ambiente; para mantener la consistencia, las muestras pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius. Esta figura muestra la viabilidad de embriones expuestos a 1000 partes por millón de oxígeno, 5.000 partes por millón de oxígeno y normoxia, alrededor de 210.000 partes por millón de oxígeno.
Los embriones se exponen a cada condición durante 24 horas en cámaras de flujo continuo con oxígeno. Los gusanos se trasladaron a condiciones normóxicas y se dejaron desarrollar hasta la edad adulta durante 48 horas, y luego se evaluó su viabilidad hasta la edad adulta. Tras seguir este procedimiento, se pueden recolectar muestras para su análisis posterior mediante inmunotransferencia, QPCR o ensayos fisiológicos como la duración de la vida o la producción de descendencia.
Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo configurar una cámara de hipoxia de flujo continuo en su propio laboratorio.
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Descripción general
Este artículo detalla cómo configurar y mantener una cámara de hipoxia utilizando un método de flujo continuo para crear concentraciones definidas de O2. El sistema está diseñado para ser fácil de usar y adaptable a diversos experimentos biológicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Investigación sobre hipoxia
Antecedentes
- Comprender las respuestas biológicas a bajos niveles de oxígeno es fundamental.
- Las cámaras de hipoxia permiten estudios controlados sobre la privación de oxígeno.
- Los métodos de flujo continuo mejoran la fiabilidad de las condiciones hipóxicas.
- Estudios previos han mostrado efectos variables de la hipoxia en diferentes organismos.
Objetivo del estudio
- Establecer un método confiable para generar condiciones hipóxicas.
- Investigar los efectos de la hipoxia en muestras biológicas.
- Mostrar la flexibilidad del sistema para diversas configuraciones experimentales.
Métodos Utilizados
- Fabricación de tubos, frascos y cámaras para el montaje de hipoxia.
- Conexión de un tanque de oxígeno para controlar los caudales.
- Hidratación del gas mediante un frasco de burbujas lleno con agua desionizada.
- Colocación de las muestras de prueba en la cámara de hipoxia para su exposición.
Resultados principales
- Se demostró la capacidad del sistema para crear condiciones hipóxicas específicas.
- Se observó letalidad embrionaria dependiente de Hi F1 en ambientes hipóxicos.
- Los resultados indicaron una viabilidad variable hasta la edad adulta bajo estrés hipóxico.
- Se validó la eficacia de la cámara de hipoxia de flujo continuo.
Conclusiones
- La cámara de hipoxia de flujo continuo es una herramienta versátil para la investigación biológica.
- Permite un control preciso de los niveles de oxígeno en condiciones experimentales.
- Los hallazgos contribuyen a comprender el impacto de la hipoxia en el desarrollo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de condiciones hipóxicas precisas y reproducibles es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas en modelos de enfermedad donde la tensión de oxígeno influye en la actividad de las vías metabólicas. Este método permite generar de forma escalable y de bajo costo entornos definidos de O2 para apoyar cribados mecanicistas y ensayos fenotípicos en sistemas genéticamente modificables. Al reducir la variabilidad en la exposición a la hipoxia, mejora la confianza predictiva en los flujos de trabajo iniciales de descubrimiento dirigidos a vías sensibles a la hipoxia.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de respuestas transcripcionales dependientes de HIF-1 bajo concentraciones controladas de O2 para validar dianas sensibles a la hipoxia.
- Valor operativo: Facilita el muestreo rápido tras la exposición hipóxica para capturar cambios transitorios en la señalización antes de su reversión.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona condiciones cuantitativas y reproducibles definidas por O2 para la selección de compuestos que modulan las vías de respuesta a la hipoxia.
- Valor operativo: La transparencia de la cámara permite la visualización en tiempo real de las respuestas fenotípicas durante la exposición al gas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la modelización de la relación dosis-respuesta de niveles de O2 para trazar los efectos dependientes de la concentración sobre el desarrollo y la supervivencia.
- Valor operativo: Adaptable a otros sistemas modelo y gases (por ejemplo, CO2, H2S) para una modelización fisiopatológica más amplia.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
Este método se enmarca en el continuo de descubrimiento que va desde la verificación de hipótesis sobre dianas hasta la validación de ensayos, particularmente para vías moduladas por la disponibilidad de oxígeno.
- Biología del Descubrimiento: Permite un control preciso del O2 para aislar efectos dependientes de HIF-1 en estudios de validación genética.
- Selección: Genera condiciones hipóxicas estables y equilibradas adecuadas para la selección de compuestos con alta reproducibilidad.
- Análisis: Permite realizar ensayos posteriores de viabilidad, expresión transcripcional o proteica tras intervalos hipóxicos definidos.
- Investigación Traducional: Relaciona la concentración de O2 con resultados fenotípicos relevantes para isquemia, microambiente tumoral o trastornos del desarrollo.
- Reutilización Empresarial: El diseño modular permite su adaptación en diferentes laboratorios y sistemas modelo sin necesidad de revalidar los principios básicos de suministro de gases.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al permitir experimentos con titulación precisa de O2 en modelos genéticamente accesibles.
- Valor operativo: La configuración de bajo costo y fácil fabricación aumenta la accesibilidad y la estandarización entre grupos de investigación.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos confiables sobre la modulación del blanco en niveles de O2 fisiopatológicamente relevantes.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos dirigidos a la hipoxia mediante lecturas fenotípicas reproducibles.
Consideraciones de Implementación
- Requiere conocimientos básicos en manipulación de gases y acceso a tanques de O2/N2 comprimidos con concentraciones certificadas.
- Depende de instrumentación para el control de flujo (por ejemplo, controladores de flujo másico) y materiales para la fabricación de cámaras herméticas al gas.
- Necesita SOP estandarizados para el sellado de la cámara, la hidratación del gas y la carga de muestras, a fin de garantizar la reproducibilidad.
- Debe tener en cuenta los rangos de tolerancia al O2 específicos del modelo al trasladar los experimentos entre especies o tipos celulares.
- Está limitado por el volumen de la cámara y la dinámica del flujo, lo cual puede afectar el tiempo de equilibrio en formatos de alto rendimiento.
