Generación, purificación y caracterización de especies invasivas en células de proteína DISC1

El objetivo general de los siguientes procedimientos es generar discos purificados. Uno agrega capaces de invadir células receptoras. Se demostrarán dos métodos diferentes para lograr este objetivo, utilizando el primer método.

La proteína fluorescente que forma el complejo disco uno está sobreexpresada en células donadoras de neuroblastoma humano NLF. Luego, las células se lavan con PBS, se recogen y se lisan sin el uso de detergentes. El ADN se digiere y las zonas de agarosa se purifican utilizando un sistema de gradiente de sacarosa.

Los agrios purificados mediante este método tienen una baja eficiencia de invasión celular. El enfoque alternativo consiste en sobreexpresar los aminoácidos 598 a 785 de la proteína recombinante disc una en E. coli. Luego, el fragmento proteico se marca con DITE 594, se dializa y se purifica utilizando una matriz NI NTA, lo que elimina cualquier resto de colorante no unido y el disc multimérico.

Los fragmentos uno generados mediante este método tienen una alta eficiencia de invasión celular para evaluar la invasión de células hospedadoras. Ya sea el disco purificado de proteína fluorescente, los uno risomas o el disco recombinante marcado. Se incuban fragmentos uno con las células receptoras de interés.

Azul de trian se agrega luego para eliminar la fluorescencia extracelular y la invasión se visualiza mediante microscopía confocal. Hasta ahora, la agregación de proteínas no ha sido una característica reconocida de las enfermedades mentales crónicas como la esquizofrenia. Donde la proteína uno interrumpida en la esquizofrenia es un candidato para la invasividad celular, la agregación de proteínas es una característica distintiva de las enfermedades por mal plegamiento proteico.

Aquí mostramos mediante dos métodos que los agregados de la proteína disc uno son invasivos para las células, y por lo tanto que las alteraciones relacionadas con disc uno o las neuropatías asociadas a disc uno son trastornos conformacionales de proteínas. Los dos métodos son, en primer lugar, la purificación de disc completo, un ASOS proveniente de líneas celulares de neuroblastoma, y en segundo lugar, la expresión de un fragmento multimérico del extremo C-terminal de disc uno en *E. coli*, así como la purificación y marcado con un colorante fluorescente.

Si bien el primer método solo provoca una baja eficiencia de invasión celular del 0,3 % de las células que incorporan los microsomas purificados, el fragmento proteico recombinante purificado infecta hasta el 20 % de las células expuestas. Los métodos descritos aquí deberían ser transferibles a otras proteínas en las que se haya demostrado convincentemente la formación del acrosoma o el ensamblaje multimérico. En cada uno de los 10 platos de 10 centímetros.

Siembre 1,5 × 10⁶ células de neuroblastoma humano y células LF en medio RPMI 1640 suplementado y cultive durante la noche. Al día siguiente, las células deben estar entre un 70 y un 80 % confluentes; etiquete cinco placas para transfección con PC DNA 3.1 MRFP y disc humano completo marcado con EGFP, y otras cinco para transfección solo con el plásmido EGFP. Para cada placa de 10 centímetros, combine 15 microgramos de ADN plasmídico, 30 microlitros de met afectante y 750 microlitros.

Opti MEM en un tubo de microcentrífuga y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo; incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, para transfectar las células, agregue la solución del reactivo de transfección de ADN gota a gota sobre las células, e incube las células a 37 grados Celsius con 5 %CO₂. 48 horas después de la transfección, supervise la expresión de MRFP de longitud completa del disco uno y confirme la formación de zonas de aglomeración mediante microscopía de fluorescencia. Algunas células albergan inclusiones masivas de proteína fluorescente como se muestra aquí.

Este protocolo combina un método para purificar cuerpos de Lewy a partir de tejido cerebral y el protocolo para aislar agregados más grandes o zonas de agregación, ya que los métodos ya existentes se basan en el uso de detergentes, siendo fundamental el aislamiento de proteínas libres de detergentes para su aplicación en ensayos de invasividad celular. A continuación, aspire el medio y lave con PBS, y añada 400 microlitros de PBS que contenga una mezcla de inhibidores de proteasas. Luego raspe las células y añada un mililitro de suspensión celular y 10 esferas cerámicas a un tubo de lisis de dos mililitros.

Lise las células utilizando tres pulsos de 62 segundos en un homogenizador pre-célula lyse 24. La fuerza mecánica del proceso puede aumentar la temperatura dentro de la muestra por encima de 37 grados Celsius. Por lo tanto, se debe tener cuidado de enfriar la muestra en hielo. Después del procedimiento de lisis, tras enfriar las células en hielo, agregue cloruro de magnesio 10 milimolar y 40 unidades por mililitro de ADNasa, e incube durante 60 minutos a 37 grados Celsius con agitación.

Prepare 10 mililitros de cada solución de sacarosa al 80 %, 50 % y 20 % peso por volumen en PBS. Luego, en un tubo cónico de 15 mililitros, prepare el gradiente de sacarosa comenzando con dos mililitros de sacarosa al 80 %, seguido de dos mililitros de sacarosa al 50 % y dos mililitros de sacarosa al 20 %. Vierta el gradiente lentamente y tenga cuidado de no perturbar las capas ya depositadas.

A continuación, coloque el lisado digerido encima del gradiente y centrifugue durante 15 minutos a 1000 veces G a cuatro grados Celsius. Con la rotura, recopile cuidadosamente la interfase entre las capas de sacarosa del 50 al 80 % con una pipeta y mezcle con cinco volúmenes en un tubo cónico de 15 mililitros; centrifugue durante 15 minutos a 1000 veces G a cuatro grados Celsius. Retire cuidadosamente el sobrenadante y conserve el pellet que contiene la zona de agregación.

Repita el lavado otras dos veces en esta interfase. Las agrizonas son fluorescentes y pueden visualizarse al microscopio bajo luz ultravioleta tras el último lavado; deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 250 a 500 microlitros de PBS. Este precipitado contiene las agrizonas purificadas.

Añada 10 microlitros de disco MRFP, una suspensión de asoma a cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contiene células de neuroblastoma humano SHSY cinco Y. Exprese constitutivamente GFP soluble disco uno en el extremo C-terminal sobre cubreobjetos de vidrio estériles e incube durante 48 a 72 horas tras la incubación. Lave las células tres veces con PBS y bloquee la fluorescencia extracelular con azul de trian al 0,04 % durante cinco minutos.

Luego, lave con PBS para eliminar el azul de trian. A continuación, coloque la placa sobre hielo y agregue PFA al 4 % en PBS durante 10 minutos para fijar las células. Después, lave una vez con agua estéril y monte las laminillas sobre portaobjetos con medio de montaje prolongado gold con DPI.

Confirme la incorporación en la invasión de forma exógena. Aplique zonas de agregación mediante la colocalización con proteínas reclutadas expresadas por las células receptoras en imágenes Zack. Este Zack abarca aproximadamente seis micrómetros de profundidad.

24 imágenes tomadas a intervalos de 200 nanómetros. La fluorescencia del disco MRFP de una zona agri mostrada en rojo recluta el dominio GFPC citosólico del disco. Un fragmento mostrado en verde indica una colocalización que aparece en amarillo y señala que las zonas agri han entrado en el citosol del receptor y reclutaron la proteína del disco uno, anteriormente soluble.

En esta parte del protocolo, el disco humano uno se etiquetará con DITE 5 94. Este D permite el monitoreo directo de la proteína recombinante sin necesidad de tinción inmunológica adicional. Comience por liberar la proteína preparada según se describe en el documento adjunto del beta-mercaptoetanol mediante diálisis tres veces en dos litros de PBS a una dilución de uno a 2000.

A continuación, marque un disco de un miligramo con DITE 5 94 IDE, disuelva un miligramo por mililitro de proteína en PBS y agregue TCEP cinco milimolar para recuperar los grupos SH libres. Añada 20 microlitros del colorante disuelto en DMF a la reacción e incube durante dos horas a temperatura ambiente. Utilizando una cinta de diálisis SLI con un corte de peso molecular de 10.000 daltons, realice diálisis de la proteína tres veces en PBS en una relación de uno a 2000, durante dos horas cada vez. A continuación, para aumentar aún más la pureza de la proteína marcada.

Se realiza una purificación por afinidad basada en etiqueta his sobre una columna de NTA-Ni. Lave una matriz de NTA-Ni de un mililitro con 10 mililitros de PBS, luego aplique la proteína dializada marcada a la columna y deje que pase a través de la columna.

Lentamente, la solución perderá parte de su color azul debido a la unión de la proteína a la matriz NTA; el colorante libre no marcado permanecerá en el flujo que atraviesa. Una vez que la solución proteica haya pasado a través de la columna, lave la columna tres veces con 20 mililitros de PBS para eluir la proteína y agregue dos mililitros de PBS que contenga 500 milimolar de ole a la columna.

Coloque la válvula a baja velocidad y eluya gota a gota mientras monitorea la banda coloreada en la columna N NI NTA. Para hacer referencia, esta fracción coloreada del eluato contiene una proteína recombinante marcada; transfiera el EIT a una cinta de diálisis SLI y realice diálisis del EIT tres veces frente a NAPI 10 milimolar con una dilución de uno a 2000 durante dos horas cada vez en dos litros. Después de la diálisis, pase el EIT a través de un filtro estéril de jeringa de 0,45 micrómetros, luego divídalo en alícuotas de cinco muestras de 100 microlitros y congélelas rápidamente en nitrógeno líquido.

La cantidad total de proteína debe ser de 0,5 a un microgramo por mililitro en cada alícuota de 100 microlitros. Para evaluar la invasividad de la proteína, añada medio que contenga de cinco a 10 microgramos por mililitro de proteína recombinante marcada disc one a cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga células de neuroblastoma humano SH SY cinco Y receptoras. Incube durante 48 a 72 horas células que expresan constitutivamente la etiqueta GFP soluble en el extremo C-terminal de disc one sobre laminillas de vidrio estériles.

Detenga la fluorescencia extracelular, fije y monte las células como se hizo con las células tratadas con la zona agri; confirme la invasión de la proteína recombinante aplicada exógenamente mediante Zack Imaging. Cuando la proteína marcada es incorporada, se detecta dentro del perímetro de las células receptoras en imágenes generadas por microscopía confocal. Este Zack abarca aproximadamente cinco micrómetros de profundidad en 24 pasos de 220 nanómetros.

Aquí, el fragmento recombinante del disco uno, del 5 98 al 7 85, mostrado en rojo, es incorporado por células receptoras que expresan el disco uno soluble con etiqueta GFP en el extremo C, mostrado en verde, para determinar la invasividad del disco uno. Se purificaron agregados de disco uno completos con etiqueta MRFP, denominados zonas agro, a partir de células NLF y se aplicaron a células receptoras SH-SY5Y, como se describe en esta foto, tal como se muestra aquí. El disco uno con etiqueta A-M-R-F-P en el acrosoma invadió una célula de neuroblastoma humano SH-SY5Y que expresa el disco uno soluble con etiqueta GFP en el extremo C.

Además, el disco uno etiquetado con MRFP fue capaz de reclutar el disco uno soluble etiquetado con GFP en agregados insolubles para determinar la invasividad. El disco uno recombinante marcado con DIA ligero se aplicó a células de neuroblastoma SH-SY5Y que expresan disco uno soluble con GFP, como se muestra aquí. La proteína disco uno recombinante, mostrada en rojo, invadió la célula receptora; los puntos amarillos indican el reclutamiento del disco uno soluble etiquetado con GFP en su extremo C-terminal hacia agregados. El disco uno recombinante expresado y purificado a partir de E. coli también mostró invasividad celular hacia neuronas in vivo cuando la proteína multimérica se inyectó estereotácticamente en la corteza prefrontal medial de una rata. La imagen de Zack confirma la presencia de la proteína disco uno recombinante en neuronas corticales de rata, teñidas con un anticuerpo contra núcleos neuronales.

Acabamos de mostrarle dos métodos para generar agregados de la proteína disc uno para estudiar la invasión celular. Mediante cualquiera de estos métodos, podemos investigar los efectos celulares de la absorción de agregados de disc uno sin las variables potencialmente confusas de la expresión génica recombinante mediante la transfección de ADN foráneo. Estas técnicas pueden aplicarse para investigar los efectos biológicos de la patología de la proteína disc uno in vitro en células, e in vivo mediante inoculación intracerebral u otra administración en modelos animales.

Estamos seguros de que estas técnicas también podrían transferirse eventualmente a otros agregados proteicos con ligeras modificaciones del protocolo adaptado a cada proteína particular. Al realizar este procedimiento, asegúrese de dedicar tiempo al análisis minucioso de las imágenes de microscopía confocal.