Celular seguimiento mediante fotoconvertible proteínas durante el desarrollo de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es rastrear células fotoconmutadas en un embrión de pez cebra vivo. Esto se logra primero incrustando un embrión que expresa una proteína fluorescente fotoconversible específica de un tejido, en agarosa de baja temperatura de fusión. A continuación, la proteína dentro de la región de interés se fotoconvierte completamente.

Luego, el embrión se extrae cuidadosamente del agarosa y se mantiene en agua de huevo a 28,5 grados Celsius hasta etapas posteriores. Finalmente, el embrión fotoconvertido se incrusta nuevamente en agarosa de baja temperatura de fusión. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que las células fotoconvertidas pueden detectarse con precisión en etapas posteriores debido a la presencia estable de la proteína fotoconvertida mediante microscopía confocal.

Por lo tanto, consideramos que el método que presentaremos hoy será bastante útil en el contexto de la biología celular y del desarrollo. Pensamos que el uso de esta metodología en el estudio de la migración celular, la dinámica tisular y otros comportamientos celulares será muy útil. El procedimiento será demostrado por Veronica Lombardo, una posdoctoranda de mi laboratorio, tras cruzar peces cebra transgénicos que expresan una proteína fluorescente fotoconvertible.

Seleccione los embriones más brillantes que sean homocigotos y críelos a 28,5 grados Celsius cuando hayan alcanzado la etapa deseada. Utilice pinzas para desenroscarlos en un recipiente de vidrio con agua de huevo para anestesiar a los embriones. Use una pipeta de vidrio o una punta de pipeta cortada para transferirlos uno por uno a trica.

Transfiera un embrión anestesiado sobre la tapa de una placa de cultivo y mantenga el embrión dentro del volumen más pequeño posible de medio. Transfiera el embrión a agaros pipeteándolo con agarosa al 1 % de baja temperatura de fusión con trica a 30 grados Celsius, y colóquelo en una placa de cultivo con fondo de cubreobjetos. Utilice una punta plástica lisa para orientar el embrión una vez que la agarosa haya polimerizado.

Cubra con la solución Trica en un microscopio confocal invertido equipado con fuentes láser de 405, 488 y 561 nanómetros y un objetivo de 20 x. Utilice los láseres de 488 y 561 nanómetros para generar una serie Z de toda la estructura del espécimen, que incluye la región de interés. Seleccione la herramienta de series temporales y configure dos ciclos sin intervalo, uno para antes y otro para después de la fotoconversión.

Seleccione la herramienta de la región y defina una o más regiones de interés para la conversión fotográfica. A continuación, seleccione la herramienta de blanqueo y configúrela para comenzar el blanqueo después del escaneo. Uno de los dos utilizados aquí es un láser de diodo de 30 milivatios y 405 nanómetros.

Optimizado cuidadosamente para utilizar la cantidad mínima de luz láser necesaria para lograr una fotoconversión completa, lo cual se consigue variando la intensidad de la luz láser, el número de iteraciones de escaneo de la región de interés y la velocidad de escaneo. Escanee la muestra con los láseres de 488 nanómetros y 561 nanómetros para visualizar cualquier fluorescencia verde residual y la fluorescencia roja fotoconvertida de la proteína fluorescente fotoconvertible. Tras la fotoconversión, deseche la solución y, utilizando una aguja o una punta de plástico lisa, retire cuidadosamente el embrión del agros.

Mantenga el embrión en agua de huevo en la oscuridad a 28,5 grados Celsius hasta el estadio de desarrollo deseado. Incruste el embrión por segunda vez, luego genere un Zack del espécimen, incluyendo la región de interés, utilizando nuevamente los láseres de 488 y 561 nanómetros. Dado que este protocolo no afecta el desarrollo normal, es posible observar el embrión fotoconvertido en estadios posteriores.

A continuación se muestra un ejemplo de un ensayo de conversión fotoquímica. Se rastrearon células endoteliales durante el desarrollo del pez cebra desde las 48 hasta las 72 horas posteriores a la fertilización, utilizando una línea transgénica reportera que expresa kick G en los núcleos endoteliales, como se observa aquí. Antes de la conversión fotoquímica, kick G se expresaba dentro del tejido endotelial y solo era detectable como fluorescencia verde mediante escaneos de control con un láser de argón de 488 nanómetros. Con un láser de 561 nanómetros para fluorescencia roja no se detectó ninguna señal de kick GR previamente convertido por fotoconversión.

Posteriormente, la región de interés fue completamente fotoconvertida utilizando un láser de diodo de 405 nanómetros a una intensidad del 10 %, durante 20 iteraciones, y los vasos craneales fueron escaneados nuevamente usando los láseres de 488 nanómetros y 561 nanómetros. En este panel, la señal verde G se había convertido completamente en roja dentro de la región de interés, lo que permitió rastrear las células endoteliales fotoconvertidas en etapas posteriores. El embrión fue observado a las 24 horas posteriores a la fotoconversión, lo que equivale aproximadamente a 72 horas post-fecundación, en tejidos endoteliales derivados de la región de interés fotoconvertida.

Se observaron tanto proteínas G kick no convertidas como convertidas por foto, debido a la estabilidad de la proteína G kick roja fluorescente convertida por foto y a la síntesis de nueva proteína G kick verde no convertida tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo exploraran la biología celular y la remodelación de tejidos en varios peces.