La MODS método para el diagnóstico de la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente

Por cada tres personas en el mundo, una está infectada con tuberculosis. Diagnosticar la tuberculosis activa previene nuevas infecciones porque los pacientes con tuberculosis activa infectarán entre 10 y 15 personas más por año hasta que sean tratados o fallezcan. MODS es un acrónimo que utilizamos para evitar tener que decir observación microscópica y ensayo de susceptibilidad a fármacos, y la razón por la que se llama así quedará clara a medida que se explique la metodología.

En el breve video, describiremos la metodología MODS para el diagnóstico rápido y económico de la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente. El video presentará la metodología paso a paso. Discutiremos las implicaciones de bioseguridad del trabajo con cultivos líquidos, y también explicaremos algunos aspectos importantes de control de calidad necesarios para el uso de esta metodología.

El ensayo mods fue desarrollado en la Universidad Kayana en Lima, Perú, en el laboratorio de Bob Gilman. Tras observaciones realizadas inicialmente por loose cavi. LOOSE intentaba identificar métodos rápidos para detectar Mycobacterium tuberculosis en cultivos utilizando indicadores colorimétricos.

Pero señaló que la observación de esas culturas bajo el microscopio reveló la presencia de crecimiento de microbacterias varios días antes de que los indicadores colorimétricos cambiaran de color, y fue en esa observación en la que se basó el desarrollo del ensayo MOD. El ensayo MOD fue desarrollado en un entorno con recursos limitados y está dirigido a entornos con recursos limitados, por lo tanto, con un costo ligeramente inferior a 3 dólares por prueba para la detección de TB basada en cultivo líquido y la detección de resistencia múltiple a fármacos. Es extremadamente atractivo y, por primera vez, lleva este tipo de capacidad diagnóstica a lugares donde los recursos son limitados.

Por lo tanto, el ensayo MODS se basa en tres principios fundamentales. El primero es que Mycobacterium tuberculosis crece en medios líquidos mucho más rápidamente de lo que lo hace en medios sólidos. Este es un hecho que se ha conocido durante muchos años.

En segundo lugar, si observamos esos medios líquidos bajo el microscopio, podemos detectar el crecimiento de *M. tuberculosis* mucho más rápidamente que esperando la aparición macroscópica de colonias en medios sólidos. De hecho, ese crecimiento es completamente característico, de modo que podemos distinguir *M. tuberculosis* en medios líquidos de una contaminación bacteriana o fúngica, o incluso del crecimiento de micobacterias atípicas no tuberculosas que pudieran estar presentes. Finalmente, y esto es quizás lo más interesante del ensayo MODS, es que podemos incorporar fármacos como la rifampicina y, por lo tanto, detectar directamente desde el esputo la resistencia múltiple a fármacos.

Al utilizar esos fármacos desde el inicio del ensayo, podemos detectar tanto la tuberculosis como, al mismo tiempo, si el aislado es resistente o no a esos dos fármacos. Esto elimina la necesidad de realizar un subcultivo y crear una prueba indirecta de susceptibilidad a fármacos. Ahora simplemente describiremos el equipo necesario para realizar el ensayo MODS.

Se necesita un refrigerador para almacenar los medios preparados. Se requiere una balanza para pesar el IS y la rifampicina. Un vórtex es necesario para mezclar el esputo.

Con la solución de descontaminación, se requiere una centrífuga para concentrar la muestra de esputo descontaminada, y esta debe ser capaz de alcanzar 3000 G. La centrífuga no necesita estar refrigerada, pero es absolutamente esencial que sea segura a nivel biológico, es decir, que sea biossegura. Para trabajos con micobacterias, se requiere que los portamuestras de la centrífuga puedan sellarse con tapas bloqueables. Se necesita un incubador capaz de alcanzar y mantener 37 grados centígrados.

Este no necesita estar enriquecido con CO₂. Se requiere un microscopio invertido para leer las placas MODS, el cual debe tener objetivos de 4x y 10x, y se necesita una autoclave para esterilizar los medios y también para la eliminación de cultivos microbianos. Son necesarios microtubos desechables para las alícuotas en los medios, así como una cabina de seguridad biológica. Se requiere una cabina de clase dos para procedimientos que impliquen la manipulación de muestras de esputo e inoculación de placas.

Los reactivos necesarios para realizar el ensayo mods son los siguientes: medio Middlebrook 7H9, casitone y glicerol, PANTA (que es el suplemento antibiótico) y OADC. Los stocks de suplementos nutricionales, las soluciones de antibióticos como rifampicina en dimetilsulfóxido (DMSO) para la preparación de rifampicina, hidróxido de sodio, citrato de sodio y N-acetilcisteína para la descontaminación del esputo, dihidrógeno fosfato de sodio y fosfato monopotásico para la preparación del tampón fosfato, hipoclorito de sodio al 10 % para la eliminación de residuos infectados y desinfectante para la limpieza de las superficies de trabajo. También se requieren los siguientes plásticos y materiales desechables: tubos de vidrio estériles, filtros de 0,2 micrómetros para disolventes acuosos y filtros de 0,2 micrómetros para disolventes orgánicos, tubos para microcentrífuga, tubos centrífugos de 15 mL, tubos serológicos estériles de 50 mL y 10 mL, puntas estériles para micropipeta, placas de cultivo celular de 24 pocillos y bolsas herméticas tipo Ziploc en las que se colocan las placas de 24 pocillos después de inocular la muestra de esputo en el medio.

Existen cuatro grupos de soluciones stock que pueden prepararse por anticipado. La solución de tampón fosfato se elabora combinando soluciones de fosfato de sodio, diba y fosfato monoácido de potasio, ajustadas a un pH de 6,8 ± 0,2. Esta solución se esteriliza en autoclave a 121-124 grados centígrados durante 15 minutos, y se cultiva una alícuota en agar nutriente para confirmar la esterilidad.

Esto se puede almacenar en el refrigerador a dos a ocho grados centígrados durante un mes como máximo. Cada muestra de esputo requiere 10 mililitros de solución tampón fosfato. La solución stock para la descontaminación de esputo es una combinación de hidróxido de sodio y citrato de sodio.

Estas soluciones se combinan en volúmenes iguales y se autoclavan a 121-124 grados centígrados durante 15 minutos, y también pueden almacenarse en el refrigerador a 2-8 grados centígrados durante hasta un mes. Se requieren dos mililitros de esta solución por cada muestra de esputo. El medio de cultivo básico está compuesto por Middlebrook 7H9 con casitone y glicerol.

El polvo siete H nueve se disuelve en agua destilada estéril que contiene glicerol y casación, y se mezcla con agitación constante hasta que se disuelva completamente. Este medio se autoclava a 121-124 grados centígrados durante 15 minutos, y tras enfriarse, se divide en alícuotas de 4,5 mililitros en tubos de vidrio estériles de 16 por 100 milímetros. El medio se incuba a 37 grados durante 48 horas para verificar la esterilidad, lo cual se indica por la ausencia de turbidez tras este periodo, y puede almacenarse a 2-8 grados centígrados con la tapa firmemente cerrada hasta por un mes.

Cada muestra de esputo requiere un tubo que contenga 4,5 mililitros de este cultivo. Las soluciones stock de antibióticos para el medio se preparan de la siguiente manera: se disuelven completamente en agua destilada estéril y se filtran con un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros para disolventes acuosos. A continuación, alícuotas de 20 microlitros pueden almacenarse en tubos estériles para microcentrífuga a menos 20 grados centígrados durante hasta seis meses; cada alícuota de 20 microlitros es suficiente para hasta cien muestras.

Se preparan soluciones stock de rifampicina de ocho miligramos por mililitro disolviendo rifampicina en DMSO y agua destilada estéril. Esta mezcla se filtra con un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros para disolventes orgánicos, y la solución puede almacenarse en alícuotas de 20 microlitros en tubos estériles de microcentrífuga a menos 20 grados centígrados durante hasta seis meses. Cada alícuota de 20 microlitros es suficiente para hasta 100 muestras. Ahora pasamos a la parte del método propiamente dicho y a los tres pasos que debe seguir el día del procedimiento.

Esto consiste en convertir las soluciones stock en soluciones de trabajo. Primero tenemos la solución de descontaminación, luego tenemos la solución de medio. Y finalmente, las soluciones de trabajo de los fármacos isen y Rifampin.

El método de descontaminación, que se utiliza para la metodología mods, es la metodología estandarizada de descontaminación con hidróxido de sodio nalk. El nalk es un mucolítico, que ayuda a digerir el esputo y permite que el hidróxido de sodio realice la descontaminación. Para ello, necesitamos nuestra solución stock de hidróxido de sodio y citrato de sodio, y se añaden 0,1 gramos de NA a 20 ml de dicha solución.

Cualquier solución que no se utilice el día de su preparación debe descartarse. La preparación final del medio de cultivo también debe realizarse únicamente el día de su uso. El medio H nueve almacenado se combina con OADC y Panta; 4,5 mililitros del medio se combinan con 0,5 mililitros de OADC y 0,1 mililitros de Panta en cada tubo.

Esto es suficiente para una muestra. Las soluciones trabajo de cada fármaco se preparan el día de su uso y cualquier solución que no se utilice debe descartarse, ya que no se puede garantizar su actividad. Los alícuotas almacenados se diluyen en placas de cultivo celular de 24 pocillos serialmente con medio siete H nueve oh A DC, de modo que la concentración final en el pocillo que se obtiene después de añadir la muestra de esputo con medio sea de 0,4 microgramos por mililitro de ácido fórico y 1 microgramo por mililitro de rifampina.

A continuación, en el procedimiento de descontaminación, se coloca una muestra de esputo de dos ml en un tubo cónico tipo Falcon y luego se añaden dos ml de nuestra solución descontaminante de hidróxido de sodio al 2%. Se vuelve a colocar la tapa y se enrosca firmemente, después de lo cual la suspensión se mezcla en vórtex y se deja reposar durante 15 minutos, tiempo durante el cual ocurre el proceso de descontaminación. Transcurrido este tiempo, se añaden 14 mililitros de solución tampón de fosfatos.

Se reemplaza la tapa y se enrosca firmemente, y el tubo se coloca en la centrífuga tras 50 minutos a 3000 G; el sobrenadante S se decanta y el precipitado que queda es la muestra que deseamos sembrar utilizando los tubos de 5,1 mililitros de siete H nueve OEDC panter. Nuestro precipitado se resuspende hasta un volumen de aproximadamente dos mililitros. La mitad de esta muestra resuspendida se almacena como respaldo en un tubo de microcentrífuga.

Esto queda disponible en caso de que nuestra cultura se contamine y necesitemos volver a sembrar la muestra. El otro mililitro se añade al resto de los siete H nine oh a DC panter que se encuentra en nuestro tubo de vidrio, y esta es nuestra muestra que está lista para ser sembrada. Se colocan 900 microlitros de esta suspensión de medio y muestra en cada uno de cuatro pozos de una columna de una placa de 24 pozos.

Los pozos restantes de la placa de 24 pozos se llenan con muestras subsiguientes de manera que cinco muestras ocupen una placa de 24 pozos, una por cada una de las cinco columnas, y la sexta columna se deja sin muestra. La sexta columna sirve como control negativo para esta columna. Se colocan todos los componentes del medio sin muestra de esputo y cualquier crecimiento en esta columna indica claramente que existe un problema de contaminación cruzada y toda la placa debe descartarse.

Cada placa que utilizamos requiere una columna de control negativo. Ahora tenemos nuestra placa que contiene todas nuestras muestras y medio de cultivo. Debemos agregar nuestras suspensiones de antibióticos en una placa aparte.

Hemos preparado nuestras diluciones de Rifampicina e Isid, como se describió anteriormente, y con una pipeta multicanal de cuatro canales, tomamos 100 microlitros de cada uno de estos pozos y agregamos 100 microlitros de siete H nueve OADC a cada uno de los dos pozos de control, y 100 microlitros de Rifampicina y 100 microlitros de Isid a cada uno de los dos pozos que contienen fármacos. Una vez completada la placa, se vuelve a colocar la tapa y se introduce dentro de una bolsa Ziploc; a partir de este momento, la bolsa no se vuelve a abrir, por lo tanto, cualquier cultivo que crezca en medio líquido nunca tiene la oportunidad de salir de la bolsa.

Todas las lecturas de la placa a partir de ahora se realizan dentro de la bolsa, y la bolsa se coloca en una bolsa para autoclave y se desecha al final del cultivo. De esta manera, evitamos la manipulación de suspensiones altamente concentradas de micobacterias. Ahora mencionaremos brevemente el control de calidad.

Existen controles de calidad integrados en la metodología mods, que son esenciales para el uso adecuado del ensayo. En primer lugar, hay controles negativos, los cuales se realizan en cada placa. Estos ya se han mencionado anteriormente, pero en resumen, tenemos una columna que contiene todos los componentes del medio sin la presencia de una muestra de esputo, junto con otras cinco muestras de esputo en una placa; los pocillos de esta columna deben examinarse de la misma manera que cualquier otro pocillo, y la presencia de cualquier crecimiento en estos pocillos indica que ha ocurrido una contaminación cruzada, por lo que ninguno de los resultados de la placa puede considerarse confiable.

Por lo tanto, la placa debe descartarse y todas las muestras deben volver a sembrarse. Además, existen controles internos que actúan como controles positivos. Estos se analizan en una placa separada, y esta placa se prepara después de que se hayan preparado todas las demás placas de muestras al final del día, con el fin de minimizar el riesgo de contaminación cruzada dentro del laboratorio.

En esta placa separada, se utiliza una cepa completamente susceptible de Mycobacterium tuberculosis y una cepa resistente a isid y rifampicina. Si existen preocupaciones sobre el uso de una cepa multirresistente en una placa, puede utilizarse una cepa resistente únicamente a rifampina en lugar de estas dos cepas, la susceptible y la MDR. El propósito de estas cepas es demostrar no solo que el medio permite el crecimiento, por lo que todos nuestros controles positivos deben presentar crecimiento en la cavidad sin fármaco, sino también que nuestras concentraciones de fármacos son correctas; por lo tanto, los controles positivos susceptibles no deben crecer en presencia de is y rifampicina, mientras que los controles positivos resistentes deben crecer evidentemente frente a las concentraciones de rifampicina e is presentes en la placa.

Vale, ahora pasamos a la lectura de placas. Si consideramos el día de siembra de nuestras muestras como el día cero, la lectura de placas comienza el día cinco. Antes de ese momento, rara vez se observa el crecimiento de micobacterias.

Las placas se examinan bajo un microscopio óptico invertido. Es decir, las placas se examinan desde abajo hacia arriba, lo que nos permite observar muy claramente las cordones; intentar visualizar los cultivos desde arriba se ve dificultado por la condensación en la tapa de las placas, y también porque la distancia focal no es adecuada en un microscopio estándar. El examen microscópico generalmente se realiza con el objetivo de 10 x, considerándose positivo un cultivo en el que hay al menos dos unidades formadoras de colonias en ambos pocillos libres de fármaco.

La presencia de contaminación se reconoce fácilmente porque el medio se vuelve turbio y, para el día cinco, generalmente hay un crecimiento excesivo en la mayor parte del pocillo. En contraste, el crecimiento micobacteriano no provoca turbidez en el pocillo; el crecimiento inicial de las micobacterias forma estructuras pequeñas similares a comas, que progresan constantemente hasta formar cordones o enredos característicos. En el transcurso de dos semanas, un crecimiento fuertemente positivo habrá formado conglomerados de micobacterias, con los cordones visibles principalmente en los extremos.

La gran mayoría de los cultivos que van a volverse positivos lo hacen para el día 14, por lo tanto recomendamos lecturas diarias desde el día cinco hasta el día 14 y, posteriormente, lecturas cada dos o tres días según la carga de trabajo del laboratorio. En el día en que un cultivo sea claramente positivo en los dos pozos sin fármaco, deben leerse los pozos que contienen fármaco. Cualquier crecimiento en presencia de cualquiera de los fármacos indica resistencia a ese fármaco. Es muy importante tener en cuenta que si la lectura de la región de los pozos con fármaco se realiza más de una semana después de observar un cultivo positivo en los pozos sin fármaco, esto podría no representar resistencia, ya que ocasionalmente se observa un crecimiento de ruptura.

Las lecturas pueden interrumpirse al día 21 si un cultivo es negativo, ya que nunca se encuentran cultivos positivos después de este tiempo en pacientes que no reciben terapia. Tras completar 21 días de incubación, los cultivos pueden descartarse. Los cultivos permanecen dentro de sus bolsas Ziploc y se colocan en bolsas para autoclave, donde se autoclavan a 121-124 grados centígrados durante 45 a 60 minutos, tras lo cual pueden desecharse con seguridad. Ahora voy a decir algunas palabras sobre la seguridad biológica y el ensayo mods, ya que hemos estado implementando mods no solo en Perú, sino también en entornos de África y Asia.

Surge una pregunta recurrente sobre la seguridad y la biosalvedad del uso de cultivos microbacterianos en medios líquidos. Este es un temor comprensible, ya que obviamente los líquidos pueden derramarse y los medios sólidos no presentan ese riesgo; además, existe el peligro de aerosolización cuando se trabaja con suspensiones de micobacterias. Precisamente debido a estas razones es que consideramos que la metodología mod es más segura que cualquier otra metodología que requiera pruebas indirectas de susceptibilidad a fármacos.

La razón de esto es que, para la prueba de susceptibilidad indirecta, se prepara una suspensión de microbacterias con una concentración conocida. Por lo tanto, esto implica la manipulación de soluciones altamente concentradas de microbacterias, con todos los riesgos asociados de derrames y aerosolización. En contraste, la metodología MODS, como ya habrá observado, simplemente consiste en la inoculación de una muestra de esputo en nuestra placa, tras lo cual la placa se sella dentro de una bolsa de plástico.

Esta bolsa nunca se vuelve a abrir, y por lo tanto no tenemos que manipular estas suspensiones altamente concentradas. Esto no quiere decir que consideremos que la metodología de los mods es completamente segura; manipular micobacterias siempre conlleva un riesgo. Sin embargo, los datos de Corea publicados en 2006 parecieron respaldar nuestra postura de que los mods no son más peligrosos que sembrar cualquier otro cultivo.

Este fue un estudio realizado en trabajadores de laboratorio, que mostró que los riesgos laborales para los trabajadores de laboratorio que sembraban cultivos y no tenían responsabilidad en las pruebas de susceptibilidad a fármacos no eran mayores que los de aquellos que realizaban microscopía directa de esputo. En contraste, aquellos que manipulaban suspensiones de micobacterias y realizaban pruebas de susceptibilidad a fármacos presentaban tasas mucho más altas de riesgo laboral de tuberculosis. Es claramente de suma importancia que todo el personal de laboratorio esté protegido en la mayor medida posible; por ello, recomendamos firmemente que ninguno de estos procedimientos se lleve a cabo sin la protección respiratoria personal adecuada, es decir, mascarillas según la norma N95.

Además, se requiere una cabina o campana de seguridad biológica de clase dos en la que todas las áreas de escape estén filtradas mediante filtros HEPA. Por último, un mecanismo sencillo pero muy importante para evitar la turbulencia del flujo de aire dentro de un laboratorio es un cerrojo en la puerta del laboratorio que impida la entrada y salida de personal mientras se procesan las muestras. Esto reduce el riesgo de transmisión dentro del laboratorio. Así que espero que esto les haya proporcionado una buena visión general de lo que implica la metodología MODS y de lo útil que podría ser en entornos con recursos limitados, pero donde se requieren urgentemente diagnósticos de alta calidad para la TB y la TB-MDR.

Para obtener más información, puede visitar nuestro sitio web, mods peru. org, donde encontrará nuestros procedimientos normalizados detallados y la guía de usuario para mods. Además de los procedimientos normalizados para el procesamiento de muestras extrapulmonares, también contamos con una biblioteca fotográfica de micobacterias y tuberculosis, otras micobacterias y contaminaciones bacterianas y fúngicas, y además puede encontrar nuestra estrategia de aseguramiento de la calidad y el procedimiento que recomendamos para la acreditación de laboratorios que deseen comenzar a utilizar mods.

Finalmente, hay una hoja de preguntas frecuentes y agradecemos cualquier comentario de los usuarios que actualmente estén utilizando los mods, ya que se trata de una metodología iterativa. Como explicamos anteriormente, es una prueba no patentada y siempre estamos interesados en las mejoras que otros laboratorios hayan logrado implementar.