Une évaluation quantitative du lipidome levure en utilisant la spectrométrie de masse électrospray ionisation

Ce protocole permet d'analyser rapidement les composants majeurs du lipidome de la levure. Il commence par la récolte et le lavage des cellules de levure. Les cellules lavées sont placées dans un mélange de chloroforme et de méthanol (1:2) et lysées à l'aide de billes de verre.

L'ajout de chloroforme et d'eau permet de séparer les deux phases. La phase organique est récupérée, séchée, puis le film lipidique est dissous dans du chloroforme pour être stocké avant la spectrométrie de masse. Les lipides extraits sont dilués dans un mélange de chloroforme et de méthanol contenant de l'hydroxyde d'ammonium, et un mélange d'étalons internes est ajouté.

La solution lipidique peut maintenant être injectée directement dans le spectromètre de masse. Bonjour, je suis Simon Bork du laboratoire de Vladimir Teco au Département de biologie de l'Université Concordia. Aujourd'hui, je vais vous montrer une méthode permettant de quantifier les lipides de levure à l'aide de la spectrométrie de masse.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les modifications des lipides de levure dans différentes conditions de croissance. Commençons donc. Pour commencer cette procédure, resuspendez les pastilles de levure congelées préalablement préparées dans 1,6 millilitre d’eau distillée glacée, puis transférez 1,6 millilitre de la suspension cellulaire dans des tubes à centrifuger en verre à haute vitesse.

Remarquez que tout au long de cette procédure, toutes les manipulations des lipides extraits sont effectuées à l’aide de pipettes ou de seringues en verre. Étant donné que les plastiques génèrent un signal de fond important s’ils entrent en contact avec le chloroforme, commencez l’extraction des lipides en ajoutant six millilitres d’un mélange chloroforme-méthanol en rapport de un à deux et 0,8 millilitre de billes de verre mesurées dans un tube einor à la suspension cellulaire. Les volumes exacts ne sont pas critiques, pourvu que le rapport de un à deux à 0,8 pour le chloroforme, le méthanol et la levure en suspension dans l’eau soit maintenu. Vortexer.

La suspension cellulaire et les billes de verre sont mélangées deux fois pendant une minute à chaque fois, puis on ajoute deux millilitres de chloroforme et on mélange doucement, avant d'incuber cinq minutes à température ambiante avec des mélanges occasionnels. Après l'incubation de cinq minutes, ajouter deux millilitres d'eau distillée et mélanger doucement. Puis, incuber à nouveau cinq minutes à température ambiante avec des mélanges occasionnels.

Ici également, il est plus important de maintenir le rapport de deux pour deux pour 1,8 entre le chloroforme, le méthanol et l’eau plutôt qu’un volume spécifique. Une fois la seconde incubation terminée, centrifuger pendant cinq minutes à 3000 Gs à température ambiante, recueillir tout le surnageant de cette première extraction dans un nouveau tube en verre pour centrifugeuse haute vitesse, puis ajouter 3,2 millilitres de chloroforme aux culots cellulaires restants pour une seconde extraction lipidique.

Vortexez les culots cellulaires avec le chloroforme ajouté deux fois pendant une minute à chaque fois. Puis centrifugez pendant cinq minutes à 3000 Gs à température ambiante. Ajoutez le surnageant obtenu lors de cette deuxième extraction au surnageant recueilli après la première extraction. Ensuite, centrifugez les surnageants recueillis pendant cinq minutes.

À 3000 Gs et à température ambiante, les lipides extraits sont désormais dissous dans la phase organique inférieure. Jetez la phase aqueuse supérieure et transférez la phase inférieure dans un nouveau tube en verre pour centrifugeuse haute vitesse. Afin d'obtenir des spectres plus propres sur le spectromètre de masse, centrifugez la phase organique pendant cinq minutes à 3000 Gs et à température ambiante, puis transférez tout le surnageant dans un flacon en verre.

Séchez les lipides dissous sous flux d'azote, dissolvez le film lipidique desséché dans 500 microlitres de chloroforme et conservez à moins 20 degrés Celsius jusqu'à ce que les échantillons soient prêts à être analysés par spectrométrie de masse. Commencez par préparer un mélange standard des lipides dans le chloroforme, comme indiqué dans le tableau un du protocole écrit joint. Chaque lipide représente une classe différente.

Cette solution peut être conservée à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure avant l'injection des lipides extraits dans le spectromètre de masse. Combiner 10 microlitres de l'échantillon avec 10 microlitres du mélange standard de lipides. Noter que le rapport entre l'étalon et l'échantillon peut être modifié selon les besoins.

Séparer le mélange d'échantillons et de lipides standards à l'aide d'un spectromètre de masse micro Q à F, équipé d'une source d'électrospray nano fonctionnant à un débit d'un microlitre par minute. Les paramètres sont précisés dans le tableau deux du protocole écrit joint. Bien que l'utilisation de la haute résolution d'un spectromètre de masse Q à F soit avantageuse, elle n'est pas obligatoire.

Les paramètres exacts de l'instrument varient selon les spectromètres de masse. Après l'acquisition des données, les spectres de masse sont lissés, le fond est soustrait et les pics sont centrés. Enfin, exporter la liste des pics vers Excel.

Ensuite, normalisez les pics de chaque échantillon lipidique à l’aide de l’étalon interne. Selon l’application, il peut être nécessaire d’effectuer un traitement complémentaire, tel que la désisotopisation et la déconvolution. Cette méthode permet une détermination rapide et approfondie des composants majeurs du profil lipidique de la levure.

Ici, nous avons mis en évidence un lipide particulier, qui a subi une désconvolution des isotopes et a été normalisé par rapport à son étalon interne. Nous venons de vous montrer comment isoler les lipides de levure et comment déterminer les lipides de levure à l’aide de la spectrométrie de masse par ionisation électrospray. Lors de cette procédure, il est important de se souvenir d’éviter l’utilisation de plastiques et de maintenir votre échantillon dans la plage linéaire des concentrations.

Cette méthode est assez souple et de nombreux volumes peuvent être modifiés selon les besoins. Ce protocole d'extraction convient également à d'autres méthodes d'analyse des lipides, telles que la chromatographie sur couche mince et la spectrométrie de masse multidimensionnelle. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.