La quantification des protéines à l'aide d'enrichissement d'immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse
31 juillet 2011
Normes des isotopes stables et capture par anticorps anti-peptide (SISCAPA) l'enrichissement affinités couples de peptides avec des isotopes stables de dilution spectrométrie de masse (MRM-MS) pour fournir une mesure quantitative des peptides comme substituts pour leurs protéines respectives. Nous décrivons ici le protocole en utilisant des particules magnétiques dans un format partiellement automatisés.
L'objectif général de la procédure suivante est d'isoler et de quantifier des peptides dans un mélange complexe qui servent de substituts pour leurs protéines respectives. Tout d'abord, les grandes protéines présentes dans le mélange sont digérées en peptides constitutifs à l'aide d'une enzyme telle que la trypsine. Ensuite, les peptides cibles et une norme interne marquée par un isotope stable ajoutée sont enrichis à l'aide d'anticorps anti-peptides, immobilisés sur des particules magnétiques codées de protéine G après l'isolement.
Les peptides ciblés sont élusés à partir des particules magnétiques et analysés par spectrométrie de masse pour une quantification relative par rapport à l'étalon interne. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les immunoessais traditionnels, sont qu'elle est plus rapide et plus rentable pour la mise au point d'un grand nombre de tests. Elle présente un taux de réussite élevé et peut facilement être multiplexée, comme le montrera la procédure décrite ci-dessous.
Un technicien en laboratoire a un plasma Eloqua de 10 microlitres sur de la glace fondante. Transférez l'échantillon dans une plaque profonde de 1000 microlitres et couvrez avec un film parafilm. Pour dénaturer les protéines, ajoutez 20 microlitres d'urée fraîche à neuf molaire et 30 millimolaire de DTT à chaque échantillon, puis incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite trois microlitres d'iodeacétamide frais à 500 millimolaire à chaque échantillon et incubez pendant 30 minutes à l'abri de la lumière à température ambiante. Diluez maintenant l'urée à 0,6 molaire avec du Tris 100 millimolaire, pH huit, puis ajoutez 10 microlitres d'une solution mère de tripsine à un microgramme par microlitre, afin d'obtenir un rapport enzyme/substrat de un à 50.
Après avoir incubé la réaction à 37 degrés Celsius toute la nuit, ajouter trois microlitres d'acide formique pur pour obtenir une concentration finale de 1 %, puis continuer en ajoutant l'étalon isotopique stable ou plusieurs étalons. Si l'on effectue un dosage multiplexe, laver soigneusement la plaque de cartouches Oasis avec 500 microlitres d'acide formique 0,1 % dans du nitrile d'acétonitrile à 80 %, en éliminant l'éluat. Ensuite, équilibrer la plaque de cartouches en ajoutant 500 microlitres d'acide formique 0,1 % dans l'eau et jeter l'éluat.
Chargez les échantillons de digestion sur la plaque de cartouche et ajustez le vide de manière à obtenir un débit très lent. Effectuez trois lavages avec 500 microlitres d'acide formique 0,1 % dans l'eau et jetez l'écoulement. Éluerez les peptides deux fois avec 500 microlitres d'acide formique 0,1 % dans 80 % d'acétonitrile, puis lyophilisez ou séchez l'éluat sous flux d'air et reconstituez les peptides séchés dans 50 microlitres de PBS contenant 0,03 % de Chaps. Transférez les échantillons dans une plaque standard Kingfisher de 96 puits, ajoutez un microgramme d'anticorps et 1,5 microlitre de billes magnétiques sensibilisées à la protéine G par cible. Vortexez les billes avant leur ajout.
Pour garantir une bonne suspension des billes. Couvrir la plaque avec du papier d'aluminium et incuber toute la nuit avec un agitateurb centrifuge doux. Placer la plaque à 400 tr/min pendant 10 secondes afin d'éliminer tout liquide présent sur la surface du papier d'aluminium.
Retirer le couvercle en aluminium. La manipulation des échantillons s'effectue sur une plateforme Kingfisher automatisée. Laver les billes deux fois avec 200 microlitres de PBS contenant 0,03 % de CHAPS et une fois avec 200 microlitres d'une dilution au 1/10 de PBS contenant 0,03 % de CHAPS, puis éluer les peptides avec 25 microlitres d'acide acétique 5 % contenant 0,03 % de CHAPS.
Placez la plaque d'élution sur un aimant et transférez l'éluate dans une plaque de 96 puits en prenant soin de ne pas transférer les billes résiduelles. Couvrez la plaque avec le film adhésif, puis acheminez cette plaque contenant l'éluate vers le spectromètre de masse triple ou quadrupole pour analyse. La méthode MRM est établie en obtenant un spectre de masse en tandem du peptide d'intérêt, puis en choisissant et en optimisant les meilleurs ions fragments de transition.
Typiquement, une configuration pour l'analyse en MRM utilise une colonne de piégeage C18 et une colonne analytique avec deux phases mobiles. Chargez 10 microlitres de l'échantillon et élué par un gradient linéaire. Intégrez les aires des pics pour les peptides légers et lourds, puis calculez le rapport des aires des pics entre le peptide non marqué et le peptide marqué dans chaque échantillon.
Les peptides légers et lourds sont élués en même temps, et plusieurs transitions peuvent être surveillées pour chaque peptide. Afin de confirmer l'identité, la surface du pic du peptide endogène est mesurée par rapport à celle de l'étalon interne, fournissant ainsi une mesure quantitative du peptide cible. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en œuvre cette technique dans votre laboratoire. Elle peut être utilisée pour quantifier n'importe quelle protéine d'intérêt, ce qui la rend adaptée à un large éventail d'applications en recherche biologique.
Aperçu
Cet article décrit la technique d'étalonnage par standards d'isotopes stables et capture par anticorps anti-peptides (SISCAPA), qui combine l'enrichissement par affinité des peptides à la spectrométrie de masse avec dilution par isotope stable pour la mesure quantitative des peptides. Le protocole utilise des particules magnétiques dans un format partiellement automatisé afin d'améliorer l'efficacité.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Spectrométrie de masse
Contexte
- La SISCAPA permet la quantification de peptides en tant que substituts de protéines.
- La méthode améliore les dosages immuno-enzymatiques traditionnels en termes de rapidité et de rentabilité.
- Elle convient aux dosages multiplexes, permettant l'analyse simultanée de plusieurs peptides.
- La technique consiste à digérer les protéines en peptides puis à les enrichir à l'aide d'anticorps spécifiques.
Objectif de l'étude
- Isoler et quantifier des peptides à partir de mélanges complexes.
- Présenter un protocole permettant d'améliorer l'efficacité de l'analyse des peptides.
- Fournir une méthode largement applicable en recherche biologique.
Méthodes utilisées
- Digestion des protéines à l'aide de la trypsine pour générer des peptides.
- Enrichissement des peptides ciblés à l'aide d'anticorps anti-peptides sur des particules magnétiques.
- Analyse par spectrométrie de masse pour la quantification des peptides.
- Mise en œuvre d'un flux de travail partiellement automatisé à l'aide de la plateforme Kingfisher.
Résultats principaux
- La méthode SISCAPA offre un taux de réussite élevé pour la quantification des peptides.
- Elle démontre une capacité à multiplexer efficacement les dosages.
- Des mesures quantitatives sont obtenues en comparant les rapports entre peptides légers et lourds.
- La technique est adaptable à diverses protéines d'intérêt.
Conclusions
- La SISCAPA est une méthode robuste pour la quantification de peptides dans des échantillons biologiques.
- Le protocole peut être mis en œuvre dans les laboratoires pour diverses applications.
- Elle présente des avantages par rapport aux méthodes traditionnelles, ce qui en fait un outil précieux en recherche.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La mesure quantitative des protéines reste un goulot d'étranglement critique dans la validation des cibles et la découverte de biomarqueurs, domaines dans lesquels les dosages immuno-enzymatiques traditionnels se heurtent à des limites de coût, de délais d'exécution et d'interférences. La méthode SISCAPA propose une alternative évolutible et multiplexable qui renforce la confiance prédictive en phase précoce de découverte, en permettant une quantification stœchiométrique et indépendante des anticorps des peptides protéotypiques. Cela soutient les décisions portant sur le portefeuille de projets, ajustées au risque, ainsi que la continuité translationnelle depuis l'hypothèse jusqu'aux modèles précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à une quantification précise des protéines cibles dans des matrices complexes.
- Valeur opérationnelle : Réduit l'ambiguïté mécanistique en utilisant des peptides protéotypiques comme substituts stœchiométriques de la concentration en protéine.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en fournissant des données reproductibles et multiplexables pour la priorisation des cibles.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des protocoles de purification de peptides validés, compatibles avec la quantification par SRM/MRM-MS en aval.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à des étalons internes isotopiquement marqués et à une purification par billes magnétiques.
- Extensibilité : Facilite le développement de tests multiplexés pour l'évaluation parallèle de cibles sans appauvrissement du plasma.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les flux de travail de découverte et précliniques en fournissant des lectures quantitatives de peptides transposables entre différents types d'échantillons.
- Dérisquage mécanistique : Permet l'alignement de biomarqueurs grâce à une détection spécifique des peptides résistante aux interférences dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Confiance prédictive : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque par des mesures quantitatives des protéines sans anticorps.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La SISCAPA s'intègre dans le continuum de la découverte, de la validation de cibles à l'identification de composés d'intérêt, permettant la mesure quantitative des protéines comme base pour le développement de tests et les campagnes de criblage.
- Découverte en biologie : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en quantifiant les protéines cibles dans leurs contextes biologiques natifs.
- Écrans de composés : Offre une prête-à-l'emploi pour les tests grâce à un enrichissement reproductible des peptides et des lectures quantitatives par spectrométrie de masse afin d'évaluer les composés.
- Analytique : Fournit des rapports des aires des pics des peptides légers et lourds comme sorties quantitatives permettant de comparer différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Permet une continuité entre la phase de découverte et la validation préclinique grâce à une quantification standardisée des peptides.
- Réutilisation institutionnelle : Fonctionne comme une plateforme réutilisable pour la quantification multiplexée de cibles à travers différents projets et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/arrêt, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en protéomique, en enrichissement basé sur les anticorps et en spectrométrie de masse.
- Dépend de l'accès à des spectromètres de masse compatibles SRM/MRM et à des plateformes de manipulation de billes magnétiques.
- Implique une standardisation inter-équipes des critères de validation des anticorps et de sélection des peptides.
- Implique des adaptations selon les types d'échantillons, notamment le plasma, les lysats cellulaires et les extraits tissulaires.
- Comporte des limitations pratiques liées à la disponibilité des anticorps pour des peptides spécifiques et à l'efficacité de la digestion par la trypsine.
