Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l'aide mésophases lipidique

Bonjour et bienvenue au sein du groupe Biologie structurale et fonctionnelle des membranes. Je m'appelle Martin Caffery. L'objet de nos recherches est la membrane biologique, dont un schéma est présenté sur la première diapositive. Cette membrane, qui entoure la cellule ainsi que les organites intracellulaires lorsqu'ils sont présents, est une structure moléculairement fine, épaisse d'à peine deux molécules lipidiques, et parsemée de protéines.

Nous nous intéressons à la structure et aux fonctions appliquées aux lipides et aux protéines. Toutefois, dans le cadre de cette série JO, je limiterai mon attention aux protéines membranaires. Nous cherchons à comprendre comment ces protéines membranaires exercent leurs fonctions au niveau moléculaire, et ce pour deux raisons.

Tout d'abord, il y a la satisfaction intellectuelle de savoir comment fonctionne quelque chose. Ensuite, en connaissant son mode de fonctionnement, tout comme pour votre vélo ou votre voiture, il devient possible de le réparer en cas de dysfonctionnement. La conception de médicaments est une conséquence évidente de ce type de recherche.

L'approche que nous adoptons pour comprendre le fonctionnement d'une protéine membranaire au niveau moléculaire consiste à déterminer sa structure cristallographique. Cela implique d'établir la position dans l'espace tridimensionnel de tous les atomes, ou du moins de tous les atomes non hydrogénés qui composent la protéine. La méthode que nous utilisons à cet effet s'appelle la cristallographie aux rayons X en macromolécules, ou MX pour faire court.

Ici, nous observons un exemple de protéine membranaire dont la structure a été déterminée par cristallographie aux rayons X (MX), une technique qui nécessite un cristal de qualité fractionnaire de la protéine. Comme vous pouvez l'imaginer, de nombreuses étapes sont impliquées dans la détermination de structure par cristallographie macromoléculaire, comme illustré ici. Ces étapes incluent généralement l'identification d'une cible protéique membranaire, puis sa production, sa purification et sa cristallisation.

Les mesures de diffraction sont effectuées sur le cristal à l'aide d'une source de rayons X en laboratoire ou d'une source de synchrotron. Les données de diffraction sont traitées, produisant une carte de densité électronique, qui est ensuite ajustée à un modèle moléculaire. Le modèle, une fois affiné, peut être utilisé pour explorer le mécanisme d'action de la protéine et pour la conception de médicaments basée sur la structure.

L'objectif de cet article JoVE est de vous montrer comment nous produisons des cristaux de protéines membranaires de qualité fractionnée en utilisant des phases mésomorphes lipidiques selon la méthode dite « in meso ». Une revue récente de la méthode et de son champ d'application est disponible dans la référence un. Le protocole étape par étape que nous allons suivre ici est décrit dans la référence ; un organigramme résumant les étapes nécessaires et le temps requis pour mettre en place un essai de cristallisation de protéines membranaires en meso est présenté ici.

Ce vidéo couvre les étapes entourées par des lignes rouges en pointillés. Les éléments dont vous aurez besoin pour réaliser la cristallisation en milieu mésomorphe en mode manuel sont indiqués ici. Ils comprennent une solution concentrée de protéine membranaire purifiée en présence de lipide servant à créer le milieu d'hébergement, généralement du mono-oléine afin de rendre le lipide plus visible.

Dans cette vidéo, on a utilisé des solutions colorantes rouges précipitantes, des dispositifs de purification d'eau, des embouts jetables et une sélection de seringues gastight Hamilton, certaines avec des aiguilles amovibles, un coupleur à orifice étroit utilisé pour mélanger la solution protéique avec le lipide afin de produire la pâte. Un distributeur répétitif de Hamilton, des lames de microscope en verre et des lamelles. Idéalement, un ruban espaceur double face perforé silanisé pour la création de puits, une pince, de la glace pilée, des tissus, une calculatrice et, plus important que tout, votre cahier de laboratoire.

La procédure suivante est utilisée pour préparer une plaque de cristallisation en sandwich de verre. Pour le chargement, placez une lame de microscope silanisée sur le plan de travail. Retirez le couvercle protecteur en papier d'une face d'une bande de ruban adhésif double face perforé.

Placer le côté adhésif du ruban en contact avec la surface de la lame sous pression. Fixer le ruban sur la lame. En utilisant une raclette ou un rouleau, une feuille d’aluminium peut être placée entre le ruban et le rouleau afin de protéger le fond des puits.

Retirez la deuxième couverture en papier du ruban pour exposer sa surface collante supérieure. Cette procédure permet d'obtenir une lame de verre prête à être chargée, puis scellée dès que le chargement est terminé. Placez individuellement des lamelles silanisées à proximité immédiate de la lame pour un scellement rapide et efficace des puits.

Placer le lipide dans un bloc chauffant à température contrôlée à 45 degrés Celsius pendant trois minutes afin de le rendre liquide. Remarquez que le lipide utilisé est généralement du mono land. Dans cette vidéo, un colorant rouge a été ajouté au lipide pour en améliorer la visibilité pendant la fusion.

Préparez deux seringues étanches de 100 microlitres Hamilton pour l'étape de mélange lipides-protéines, retirez l'huile de fourrure en téflon de la seringue qui contiendra la solution protéique. Placez la seringue qui contiendra les lipides à côté. Dans ce cas, le fal reste en place.

Placer le raccord à orifice étroit entre les deux seringues, puis relier le raccord au doigt de la seringue à lipides. Serrer le raccord sur la seringue, mais ne pas trop serrer. Retirer le piston du corps de la seringue à lipides.

Veillez à ce que le lipide soit fondu. Régler la pipette sur 30 microlitres et prélever lentement 30 microlitres de la capsule de lipide fondu. Le flacon de lipide.

Le lipide doit être stocké sous azote ou argon à moins 80 degrés Celsius. Introduire lentement autant de lipide fondu qu'il est possible dans l'extrémité ouverte de la seringue, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air.

Insérez le piston dans le corps en contact avec le léopard fondu et faites progresser lentement le piston vers le haut du corps tout en tenant la seringue verticalement. Comme illustré, la bulle d'air piégée involontairement remonte au cours du processus et est libérée. Nous avons maintenant un bouchon de lipide fondu dans le corps dont vous devez déterminer précisément le volume.

Cela peut être fait en lisant les graduations sur le corps de la seringue. Dans ce cas, le volume est de 23 microlitres, ce qui est noté dans le cahier de laboratoire. Faites glisser la fourrure sur l'aiguille qui sort du coupleur.

Utilisez le piston pour pousser la matière grasse fondue vers le haut du barillet et lentement, délicatement, dans l'aiguille située au cœur du coupleur. Si l'aiguille est légèrement trop remplie, on observera la matière grasse qui s'échappe par son extrémité ouverte. En reculant légèrement le piston, l'excès de matière grasse peut être réabsorbé dans le coupleur jusqu'à ce qu'il soit parfaitement aligné avec l'extrémité de l'aiguille du coupleur.

Dans ce cas, l'unité de couplage de la seringue est complètement chargée et prête à être combinée avec la seringue contenant la protéine. La solution doit être centrifugée à 14 000 G pendant 10 minutes, cinq à dix minutes à quatre degrés Celsius, afin d'éliminer les grands agrégats. Avant de mettre en place les essais de cristallisation, sortez la solution protéique du seau de glace et équilibrez-la à température ambiante.

Calculez le volume de solution de protéine à utiliser pour former la phase cubique à ou près de l'hydratation complète pour l'oléane à 20 degrés Celsius. L'hydratation complète avec de l'eau se produit à environ 40 % en poids d'eau, comme indiqué sur le diagramme de phase. Rappelons que nous avons chargé la seringue à lipides avec 23 de mono à une densité de 0,94 milligramme par microlitre.

Cela correspond à 21,6 milligrammes de lipide ; ainsi, 21,6 fois quatre divisé par six, soit 14,4 milligrammes ou 14,4 microlitres de solution protéique, sont nécessaires. À l’aide d’une seringue Hamilton de 25 ou 50 microlitres, prélevez le volume requis de solution protéique, puis transférez la solution sur la pointe en téflon du piston située dans le corps de la seringue. Veillez à éviter les bulles d’air, retirez soigneusement l’aiguille, puis mesurez le volume de solution protéique dans la seringue. Celui-ci doit correspondre à la valeur obtenue à l’étape précédente.

En prévision de la combinaison avec la seringue chargée en lipides. Faites progresser soigneusement la solution protéique dans le corps de la seringue jusqu'à ce qu'elle affleure l'extrémité ouverte. Cette opération peut être observée en regardant à travers l'extrémité terminale du corps de la seringue.

La solution protéique de lipine étant chargée, les seringues sont désormais prêtes à être associées en vue de la réalisation de la Mex. Pour ce faire, vissez la seringue contenant la protéine à l'extrémité ouverte du raccord fixé à la seringue contenant les lipides. Une fois les deux seringues reliées par le raccord, un volume continu de liquide doit s'étendre du lipide contenu dans une seringue, en passant par le raccord, jusqu'à la solution protéique située dans l'autre seringue.

Pour la préparation du mélange, l'unité assemblée est tenue d'une main, une seringue dans la main droite et l'autre dans la main gauche. Un couple est appliqué aux deux cylindres jusqu'au raccord, à l'aide des doigts et du pouce des deux mains, afin de garantir que le joint étanche avec les rainures du raccord reste intact lors du serrage. L'appareil de mélange assemblé à ce stade endommagerait la maladie de la moelle épinière (ALS) et un serrage insuffisant entraînerait également des fuites.

Il s'agit d'une question d'expérience, avec les tâtonnements inévitables et les pertes occasionnelles d'échantillon. Il est donc conseillé de s'exercer avec un mélange de lipide et d'eau ou d'une solution tampon pour se familiariser avec le système avant d'utiliser une solution protéique précieuse. Pour effectuer le mélange, faire avancer le piston du côté protéine de l'unité de mélange jusqu'à sa limite à l'aide du pouce ou de l'index, ce qui expulse la solution protéique hors de la seringue protéique, à travers le raccord, et dans la seringue à lipide. Si l'unité a été correctement scellée, cette action provoquera un mouvement égal et opposé du piston du côté lipide.

Le piston du côté des lipides est maintenant utilisé pour refouler le contenu de la seringue à lipides à travers le coler et dans la seringue à protéines. Ce processus est répété de nombreuses fois. Parfois, plus d'une centaine de passages sont nécessaires pour produire une phase mixte homogène.

Au début du mélange, le déplacement du matériau en avant et en arrière à travers le coupleur peut être irrégulier et, parfois, une force supplémentaire est nécessaire pour assurer le mélange. Cela est normal. Le mélange initial s'accompagne généralement d'une opacité non uniforme dans l'échantillon, ce qui est également attendu.

Au fur et à mesure que l'homogénéisation progresse, la texture, telle qu'elle est perçue par la force nécessaire pour déplacer les pistons d'avant en arrière, devient plus uniforme et caractéristique de la phase cubique visqueuse, tout comme l'aspect visuel de la phase cubique émergente. Si les conditions sont appropriées et que la phase cubique se forme, la dispersion doit apparaître optiquement transparente dans le corps de la seringue.

Ainsi, les graduations sur le corps de la seringue doivent être clairement lisibles à travers la phase mésomorphe présente dans le corps. Dans le cas des protéines colorées, la phase mésomorphe présentera la couleur de la protéine, mais sera optiquement transparente. Un léger refroidissement de l'échantillon pendant le mélange, en plaçant brièvement le mélangeur à seringue sur de la glace, peut accélérer l'homogénéisation et l'obtention de la transparence.

Cependant, il est important de ne pas trop agiter l'échantillon ; il convient d'éviter un mélange extrêmement vigoureux, car cela pourrait entraîner une augmentation de la température de l'échantillon en raison du chauffage par friction. À ce stade, la phase cubique en mosaïque a été formée et la protéine a été réintégrée dans la bicouche lipidique. La phase en mosaïque est désormais prête à être distribuée dans les puits individuels des plaques de cristallisation.

Tout d'abord, la phase mésomorphe doit être transférée dans une seringue Hamilton de 10 microlitres montée sur un distributeur répétitif. Commencez ce processus en raccordant la seringue au distributeur. Chargez la seringue avec la phase cubique.

Retirez l'aiguille et le piston de la seringue. Laissez le manchon en téflon en place. Retirez l'écrou de fixation du distributeur à l'aide d'une petite pièce de monnaie.

Avec le bras de la crémaillère complètement retiré, insérez la seringue sans son piston ni son aiguille à travers l'anneau de maintien du distributeur. Remplacez le joint torique en veillant à ce que son côté avec nœud soit orienté vers la seringue, puis vissez-le fermement sur l'extrémité ouverte de la seringue.

Il convient de veiller à ce que la seringue soit correctement centrée dans l'anneau de maintien et que le corps soit aligné parallèlement au bras du cliquet. On peut évaluer ces deux conditions par I. Ces deux exigences sont importantes car, si le piston ne coulisse pas librement, une pression s'accumulera dans la seringue source pendant le chargement, ce qui peut entraîner des fuites. Faire passer le piston à travers l'anneau de fixation à l'aide de l'écrou de serrage, dévissé de quelques tours, et guider le piston dans l'extrémité ouverte de la seringue.

Appuyez entièrement sur le levier de cliquet pour déplacer le piston dans le corps de la seringue et vérifiez qu’il se déplace librement et complètement à l’intérieur du corps. Si la vis et la barre de guidage ont été desserrées, resserrez-les et vérifiez à nouveau que le piston se déplace librement. La seringue de distribution est désormais prête à être chargée.

Déplacez le piston d'un côté de l'unité de mélange assemblée jusqu'au repère zéro de graduation en microlitres. Pour transférer la phase mésomorphe vers l'autre seringue et le raccord. Déconnectez la seringue vide avec son UL en place de l'unité de mélange et reliez immédiatement la seringue chargée, munie du raccord, à l'extrémité filetée de la seringue de distribution de 10 microlitres.

Le degré de serrage avec lequel le couplage est effectué est critique. Comme mentionné précédemment, chargez la seringue de distribution en enfonçant le piston de la seringue de 100 microlitres afin que la phase mésomorphe passe à travers le coupleur. Si le couplage est bien serré et que le piston de la seringue de distribution se déplace librement, alors le piston devrait commencer à se déplacer dans le sens du mouvement du piston de chargement pendant que la seringue de distribution se remplit.

Déconnectez la seringue de chargement avec le raccord fixé de la seringue de distribution. Fixez une aiguille courte à extrémité plate sur l'extrémité en acier de la seringue de distribution et serrez-la soigneusement en place. Bloquez le piston sur le bras du cliquet en resserrant le nœud de l'anneau de serrage.

Il faut faire attention à ne pas trop serrer le nœud, car cela pourrait rayer et déformer le piston, le rendant inutilisable. Il est important que la course autorisée pour le bras de cliquet dans l'état serré soit limitée à un pouce maximum.

Comme indiqué ci-après, le piston aura tendance à fléchir et l'administration pourra échouer. Appuyez plusieurs fois sur le tambour à crans pour faire avancer le piston dans le corps de la seringue, comblant ainsi le volume mort de l'aiguille et chargeant cette dernière. Cette étape doit être répétée jusqu'à 10 fois jusqu'à ce qu'un filet continu de la phase mesa émerge de l'extrémité de l'aiguille.

L'aiguille est désormais prête à être utilisée pour mettre en place les essais de cristallisation, qui doivent commencer immédiatement. Il n'est pas conseillé de conserver trop longtemps la phase cubique chargée en protéine avant de réaliser les essais de cristallisation. Étant donné que certaines protéines sont instables dans la phase cubique en l'absence de précipitant ajouté, placez une plaque de cristallisation multipuits et une lame couvre-objet sur une surface surélevée de quelques centimètres au-dessus du plan de travail, afin de faciliter le chargement.

Un contraste optimal et une visibilité améliorée sont obtenus lorsque la surface est légèrement foncée. Homogénéisez les solutions de précipitant et retirez les bouchons des flacons. Réglez la pipette de distribution de précipitant sur un microlitre, en tenant la seringue de distribution verticalement d'une main, et utilisez l'autre main pour positionner la pointe de l'aiguille au centre et juste au-dessus du fond du puits.

Numéro un. Appuyez sur le bouton du distributeur répétitif pour expulser un bolus de mease sur la surface en verre. Le volume du bolus est de 200 nanolitres.

Lorsque le distributeur standard à répétition est utilisé avec une seringue de 10 microlitres, la pointe de l'aiguille ne doit pas se trouver à plus de quelques centaines de micromètres au-dessus du fond du puits. Pour assurer une distribution correcte, une délivrance reproductible est facilement obtenue. Cela demande simplement un peu de pratique. Après avoir chargé les quatre puits adjacents avec les pastilles de mease, déposez un microlitre de solution précipitante au-dessus de chaque pastille de mease.

À l’aide de deux microlitres par puits et de pointes jetables standard, placez rapidement une lame couvre-objet bien à plat sur les puits remplis afin de les recouvrir uniformément et obtenir un joint étanche à l’eau. Utilisez une spatule pour appliquer une pression sur la lame couvre-objet là où elle entre en contact avec la surface adhésive exposée du ruban espacement. Le processus de distribution du mélange et du précipitant peut être répété jusqu’à ce que tous les puits de la plaque soient chargés et scellés.

La plaque est désormais prête à être inspectée et incubée. Étiquetez clairement la plaque à des fins de suivi. Les protéines sensibles à la lumière sont généralement manipulées en enveloppant les plaques dans du papier d'aluminium avant de les placer dans la chambre d'incubation.

On peut les retirer et les examiner au microscope sous une lumière tamisée ou colorée de manière appropriée. Placer les plaques dans une chambre à température contrôlée, généralement à environ 20 degrés Celsius, selon un calendrier régulier. Examiner les parois à la recherche de la croissance de cristaux à l’aide d’un microscope à lumière polarisée muni d’un objectif 10 ou 20 fois.

Objectif, l'emploi du temps utilisé dans le laboratoire de l'auteur est le suivant : jour 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 post pose. Examiner attentivement le bolus méconnu. Ajuster la profondeur de mise au point dans l'échantillon d'une épaisseur de 140 microns.

L'examen doit être effectué à la fois en lumière normale et entre polariseurs croisés : les cristaux incolores de protéines membranaires se développant en phase cubique apparaissent ainsi en lumière normale. Les cristaux incolores de protéines membranaires se développant en mésophase apparaissent ainsi en lumière polarisée, ou ainsi. Les protéines membranaires naturellement colorées se développant en mésophase apparaissent ainsi ou ainsi en lumière normale.

Les prochaines étapes du processus global de détermination structurale consistent à récolter les cristaux et à les refroidir par cryo-refroidissement, puis à enregistrer et à traiter la diffraction des rayons X qu'ils produisent. Ces sujets sont abordés dans des articles JoVE distincts de cette série.