L'évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les conditions de cristallisation en deux dimensions les plus optimales pour la détermination structurale des protéines membranaires par cristallographie électronique. Cela est réalisé en utilisant d'abord un détergent compatible lors de la purification afin de solubiliser la protéine à partir de la bicouche lipidique native. La deuxième étape de la procédure consiste à ajouter un lipidexogène et à éliminer le détergent par dialyse du mélange protéine-lipide-détergent, ce qui conduit à la formation de cristaux en deux dimensions dans des conditions soigneusement contrôlées.

La troisième étape de la procédure consiste à faire geler rapidement les échantillons afin de les plonger dans un état vitreux. La dernière étape de la procédure est la collecte de données par cryo-microscopie électronique. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus permettant d'obtenir la structure finale de la protéine grâce à un traitement d'images computationnel des données.

Bonjour, je viens du laboratoire. Je suis à l'École de biologie de l'Institut de technologie de Géorgie. Bonjour, je suis Tina Dreted.

Je viens du laboratoire Berry au sein de l'école de chimie et de biochimie et du laboratoire Schmidt Kray de l'école de biologie à l'Institut de technologie de Géorgie. Et je suis Matt Johnson du laboratoire d'Ingleborg Schmidt Cry, école de biologie à l'Institut de technologie de Géorgie. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'évaluer les essais de choral ation 2D par em.

Nous utilisons ce protocole dans notre laboratoire afin d'identifier et d'optimiser les conditions de cristallisation en deux dimensions. Commençons donc. Pour commencer cette procédure, préparez des échantillons colorés négativement sur des grilles en cuivre de microscopie électronique en transmission, ou grilles TEM, recouvertes de carbone à 400 mailles. Déposez deux microlitres de l'échantillon de protéoliposome sous une grille TEM recouverte de carbone et incubez pendant 60 secondes.

Si l'échantillon ne se répartit pas uniformément, passez délicatement sur celui-ci avec le côté de la pointe de pipette. Ensuite, masquez le bord avec un morceau déchiré de papier filtre Watman numéro quatre. Cela garantit une élimination optimale du liquide sans retrait excessif des protéasomes liposomiques, et contribue à préserver le fin film de carbone.

Immédiatement après le séchage. Appliquer deux microlitres de la solution colorante à l'acétate d'uranyle 1 % après 30 secondes, puis sécher en partant du bord de la grille. Encore une fois, si l'échantillon contient de fortes concentrations de glycérol ou de saccharose visqueux, généralement comprises entre 10 et 20 %, plusieurs cycles de lavage de la grille avec un tampon exempt de glycérol ou de saccharose avant la coloration négative peuvent s'avérer utiles afin de permettre une coloration adéquate avec la solution d'acétate d'uranyle.

Une fois les grilles préparées, la microscopie électronique est utilisée pour visualiser l'échantillon à faible grossissement afin d'évaluer la distribution des membranes, leur morphologie et la qualité générale de la grille. Ensuite, un fort grossissement est utilisé pour obtenir des images et effectuer des transformations RIA sur ces images afin d'identifier les cristaux bidimensionnels. Pour commencer, insérez la grille dans le porte-échantillon du microscope électronique afin d'obtenir une première impression de la distribution moyenne des membranes, en utilisant un grossissement intermédiaire compris entre 2 000 et 10 000 ×.

Noter l'étendue de la distribution des membranes, leur morphologie et leur taille dans un cahier de laboratoire. Enregistrer des vues représentatives à l'aide d'une caméra CCD. Ensuite, si nécessaire, observer les échantillons avec un faible grossissement compris approximativement entre 400 et 800 x pour obtenir une vue d'ensemble des grilles.

Cela peut fournir des informations précieuses pour évaluer la préparation de la grille en révélant des problèmes liés à la concentration de l'échantillon, à une distribution inégale des protéas, des liposomes et à une rupture partielle du film de carbone. Identifier une zone d'intérêt sur la grille à un grossissement faible ou intermédiaire. Ensuite, utiliser un fort grossissement pour évaluer un éventuel ordre dans différentes membranes.

Ceci est essentiel au cours des premiers stades des essais de cristallisation en deux dimensions. Afin d'identifier des protéasomes liposomiques prometteurs présentant des zones bien ordonnées et de vérifier la reproductibilité lors des expériences ultérieures, déterminez le réglage optimal de grandissement élevé pour l'analyse des cristaux en 2D en commençant par un grossissement compris entre 50 000 et 60 000 ×. Selon les dimensions des cristaux en 2D et la taille de la maille élémentaire, le réglage de grandissement élevé peut être réduit jusqu'à 30 000 ou augmenté jusqu'à 80 000.

Ici, sur un emplacement adjacent à la zone d'intérêt de l'image, nous défocalisons d'environ moins 400 nanomètres ou davantage, s'il existe un doute quant à savoir si la zone d'intérêt est effectivement une membrane. Examiner l'échantillon à la recherche de fragments de film de carbone, de MICA ou d'autres artefacts pouvant être confondus avec des protéoliposomes. Observer également les bords afin de distinguer le repliement typique des membranes et leur morphologie.

Ensuite, inspectez la zone d'intérêt à l'aide d'une caméra CCD. En acquérant une image CCD avec un réglage optimal de fort grossissement, le réseau d'une protéine membranaire plus petite et/ou principalement hydrophobe peut ne pas être observable par simple évaluation visuelle de l'image CCD elle-même. Dans ce cas, l'image entière est utilisée pour une transformation de Fourier en ligne ou TF.

Cependant, si le réseau ordonné est petit, cette TF contiendra une quantité significative de bruit ; afin d'améliorer le rapport signal sur bruit, réduisez la taille de l'image encadrée, déplacez la zone réduite sur l'image et effectuez une TF en direct, puis ajustez la fonction gamma de la TF en direct pour une identification optimale des réseaux ordonnés. Une valeur de gamma excessivement élevée peut masquer les taches en raison des contributions du bruit, tandis qu'une valeur trop faible empêchera l'identification des taches plus faibles. Prévoyez une résolution des cristaux bidimensionnels négativement contrastés d'environ 15 angströms à une DFO de moins 400 nanomètres.

Prévoir d'identifier un à trois ordres de taches. Observer la netteté des taches et tout effet de mosaïque. Les cristaux bidimensionnels d'une petite protéine membranaire de 18 kilodaltons peuvent atteindre plusieurs micromètres de taille.

Les taches sur la TDF sont nettes et le déplacement facilement identifiable de la boîte FT en direct indique que le réseau est continu, sans mosaïque. Le réseau d'une protéine plus grande, dotée d'un domaine soluble plus étendu, peut être identifié sur le petit écran de la collection d'images T-E-M-C-C-D, et les TDF sont nécessaires pour obtenir une meilleure évaluation de la qualité du réseau, y compris des caractéristiques telles que le bruit de mosaïque dans la TDF d'une protéine désordonnée. Les liposomes peuvent être confondus avec des taches faibles ; il est donc essentiel de déterminer si les taches proviennent de cristaux bidimensionnels de petite taille ou d'un simple bruit.

Déplacez la zone pour le ft en direct. Si les taches disparaissent immédiatement, il s'agit de bruit ; en revanche, si elles restent inchangées même sur une petite zone, des cristaux sont probablement présents, car les cristaux lipidiques présentent une morphologie distincte et un ft caractéristique. Ces cristaux lipidiques peuvent également être identifiés par examen visuel d'une image et par des tailles cohérentes de maille élémentaire.

Des précipitations peuvent survenir lors des essais initiaux. Un examen à fort grossissement permet de distinguer la précipitation protéique des agrégats lipidiques. En cas d'agrégats lipidiques, la reconstitution pourrait en réalité avoir eu lieu, et les prochaines expériences nécessiteront uniquement un ajustement des paramètres visant à augmenter la taille de la membrane et à favoriser l'ordre, plutôt qu'à induire la reconstitution à 30 000 à 50 000 ×.

Les bords de ces structures sombres révèlent qu'elles sont constituées de membranes dépourvues de protéine. Les échantillons de précipitation obtenus dans des conditions optimales contiendront un pourcentage élevé de cristaux bidimensionnels. Il n'est pas nécessaire de viser une apparence homogène des membranes, car les cristaux 2D les plus grands et les mieux ordonnés sont sélectionnés visuellement pour la collecte de données.

Ces types d'échantillons seront facilement reconnaissables lorsque la cristallisation de tels échantillons est utilisée pour la collecte de données en microscopie électronique cryogénique afin d'obtenir le nombre maximal d'images haute résolution. Nous allons simplement vous montrer comment analyser la présence de cristaux 2D de petites protéines membranaires en microscopie électronique en transmission lors de cette procédure. Il est important de se rappeler d'être rigoureux afin de ne pas négliger une condition de cristallisation prometteuse, car vous avez déjà consacré une quantité importante de temps et d'efforts jusqu'à ce stade.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.