Utilisation d'un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Bonjour et bienvenue dans le groupe Étude de la structure et de la fonction des membranes. Je m'appelle Martin Caffery. Il s'agit d'un nouvel article d'une série publiée par JOVE sur la cristallisation des protéines membranaires en vue de la détermination de leur structure, en utilisant la méthode dite « in meso » ou de la phase cubique lipidique.

Dans le premier article, JoVE 1 7 1 2, nous avons montré comment préparer la phase cubique chargée en protéines et comment dispenser manuellement la phase visqueuse et collante de misa dans des plaques sandwich en verre pour les essais de cristallisation. Cet article vidéo décrira des méthodes utilisant un robot de cristallisation in meso. Un robot offre les avantages de la rapidité, de la précision, de la miniaturisation, ainsi que la capacité de fonctionner pendant de longues périodes dans des conditions inconfortables, comme dans l’obscurité ou à basse température.

Les robots, lorsqu'ils sont utilisés correctement, peuvent améliorer considérablement la productivité de la recherche sur la structure et la fonction des protéines membranaires. Dans cet article vidéo, nous démontrons l'utilisation de trois robots disponibles commercialement. Le premier robot a été mis au point par le groupe de biologie structurale et fonctionnelle membranaire et est décrit en détail dans la référence un.

Les deux autres sont tout récemment devenues disponibles et sont incluses ici par souci d'exhaustivité. La préparation de la plaque de cristallisation, nécessaire pour réaliser un essai de cristallisation de manière robotisée, commence par la préparation de la plaque de base du dispositif en sandwich de verre. Comme décrit en détail dans la référence, la plaque de base doit d'abord être silanisée, puis un entretoise perforé double face créant les puits doit être appliqué sur la plaque. Les matériaux nécessaires à cette opération sont indiqués ici.

Ils comprennent une plaque de base en verre pour la cristallisation, un espaceur double adhésif perforé, une solution de montage, un rouleau ou un brayon, des mouchoirs en papier et un bécher d'eau UE. La plaque est placée sur une serviette en papier posée sur un plan de travail. Quelques gouttes de solution de montage sont appliquées, puis réparties uniformément sur la surface de la plaque à l'aide d'un mouchoir en papier.

On lave l'excès de solution d'hydrophobisation en immergeant complètement la plaque dans un bécher d'eau. La plaque est retirée du bécher et placée sur une serviette en papier sèche, côté silanisé vers le haut, et sa surface exposée est asséchée par des légers passages avec des serviettes en papier.

Ensuite, le couvercle protecteur du séparateur adhésif double face perforé est retiré et le séparateur est appliqué sur la surface silanisée de la lame de verre. Il est important que le séparateur soit correctement positionné sur la plaque de base, l'angle supérieur gauche ainsi que les deux côtés adjacents du séparateur et de la plaque devant coïncider. Un rouleau ou un brayon est utilisé pour aplatir le séparateur sur la plaque de base et assurer un joint étanche entre les deux.

Notons incidemment que des plaques compartimentées complètes, munies d'espaceurs perforés, sont disponibles commercialement, comme décrit dans la section de référence. Après avoir préparé la plaque de base pour la cristallisation, nous passons ensuite à la mise en place et à l'utilisation du robot « in meso ». Comme indiqué ci-dessous, nous démontrons l'utilisation de trois robots « in meso ».

Dans tous les cas présentés, les robots sont installés et utilisés dans une pièce à température contrôlée réglée à 20 degrés Celsius dans le meso robot un, le premier meso robot à être démontré dans cette vidéo. L’article a été développé dans le laboratoire du chercheur principal et est désormais disponible à l’échelle commerciale. Des informations complètes sont disponibles dans la section de référence.

Les matériaux et l'équipement nécessaires pour mettre en place robotiquement un essai de cristallisation sont présentés ici. Ils comprennent un cahier de laboratoire, une solution de protéine chargée, fraîchement préparée comme décrit dans le JoVE Article 1 7 1 2 et conservée dans une seringue Hamilton. Des plaques de base silanisées avec des entretoises et un verre de couverture correspondant, une bouteille d'eau et des mouchoirs, ainsi que le robot In Miso.

La première vue montre le robot avec son plateau vide. La vue suivante montre le robot complet, équipé de la station de stationnement de l'humidificateur, de la plaque de base pour la cristallisation et du bloc à puits profonds contenant les solutions de précipitant. Nous commençons la configuration en plaçant la plaque de base sur le plateau du robot.

Il possède sa propre plateforme, clairement marquée avec des positions de puits destinées à l'alignement du plateau de base. Le plateau doit être clairement étiqueté à des fins d'identification. Le bloc de 96 puits contenant les solutions de précipitant est fixé sur sa propre plateforme, située sur la platine du robot à côté du plateau de cristallisation.

Le bloc est ouvert en retirant soigneusement son capuchon en plastique. Le flux d'humidité provenant de l'humidificateur est dirigé pour s'écouler au-dessus et à travers la plaque de base située sur la platine du robot lors de la configuration du robot. Le robot est initialisé en suivant les instructions du fabricant.

Nous ne détaillerons pas cela ici car les protocoles exacts évoluent au fil du temps. Ce qui se produit essentiellement lors de l'initialisation est que le bras de distribution de méase du robot se voit attribuer des positions de référence dans trois directions orthogonales, x, Y et Z. Ensuite, la phase méza chargée en protéine, contenue dans une seringue Hamilton équipée d'une aiguille de distribution, est fixée au bras numéro un du robot. Les modalités précises de préparation de la phase méza et de la seringue sont décrites dans l'article JoVE 1 7 1 2 ainsi que dans la référence 1. L'extrémité de l'aiguille de la seringue de distribution doit désormais être alignée avec le fond et le centre du puits le plus haut, situé dans le coin supérieur gauche de la plaque de cristallisation. Cela correspond à l'identifiant de puits A1, l'alignement avec le fond du puits A1 étant la première étape à accomplir.

Cela se fait en ajustant la hauteur ou la coordonnée Z du bras de distribution après avoir observé à quelle distance la pointe de l'aiguille se rapproche du fond du puits. On peut juger que la pointe touche juste le fond du puits en déplaçant manuellement la plaque de côté à côté sur la plateforme tout en ajustant très légèrement la hauteur du bras de distribution ; la coordonnée Z du bras de distribution au moment où la pointe entre en contact avec le fond du puits est alors saisie dans l'ordinateur. La distribution est programmée pour s'effectuer avec la pointe de l'aiguille située à plusieurs micromètres de cette position Z de référence, correspondant à la surface de la plaque de base. Le robot est ensuite activé pour exécuter une série d'étapes déclenchées par l'utilisateur afin de positionner la pointe de l'aiguille au centre du puits A1.

La coordonnée de référence XY du bras de distribution, correspondant au centre de la pointe, est stockée dans l'ordinateur qui contrôle le robot. Elle est utilisée pour définir le centre des autres puits de la plaque. Une fois ces coordonnées de référence définies dans l'ordinateur, on commande au bras de distribution mease de revenir à sa position initiale, amorçant ainsi la seringue.

La seringue de distribution doit maintenant être amorcée. Cette étape est effectuée afin de s'assurer que du mease frais remplit l'aiguille de distribution et que le premier puits de la plaque reçoit la quantité complète de mease prévue. Une commande d'amorçage est disponible dans le programme qui pilote l'activation du robot.

Il provoque l'avancement progressif du piston dans la seringue sous le contrôle de l'utilisateur. Pendant ce temps, l'extrémité de l'aiguille est examinée pour vérifier l'apparition du mésa ; la phase mésa est ensuite retirée à l'aide d'un tissu. Ceci achève le processus d'amorçage du robot.

Le robot est désormais prêt à fonctionner en mode automatique en démarrant l'exécution. Le programme XAP du robot initie une série d'étapes de rinçage au cours desquelles les pointes de distribution du précipitant situées sur le bras deux du robot sont lavées et préparées pour aspirer les solutions de précipitant à partir du bloc de puits profonds. L'activation de la fonction de distribution sur le robot met en mouvement le chargement séquentiel des puits : les huit premiers puits sont d'abord remplis avec la solution protéique (mease), suivis par les solutions de précipitant entre chaque distribution. Le bras de distribution de la mease revient ensuite en position de stationnement, où l'extrémité de l'aiguille est placée dans une éponge humide afin d'empêcher la mease située à la pointe de sécher.

Le plus souvent, les valeurs utilisées lors des essais de cristallisation réalisés dans le groupe de biologie structurale et fonctionnelle des membranes sont de 50 nanolitres d’enzyme et de 800 nanolitres de solution de précipitant. Le programme pilotant le robot dans cette démonstration a été configuré de manière à ce que les deux bras se déplacent simultanément.

Ainsi, il est possible de remplir une plaque de 96 puits avec la solution mère et le précipitant en cinq minutes. Dès que la plaque est remplie, les bras robotiques retournent à leurs positions de stationnement. La plaque est alors retirée du plateau du robot et placée sur une surface plane et solide.

Un couvre-objet est déposé délicatement sur la plaque de base, en contact avec la surface adhésive supérieure de l'espacement. Il est important de s'assurer que les 96 puits sont entièrement recouverts, que le couvre-objet est parfaitement aligné avec la plaque de base et qu'aucune partie du couvre-objet ne dépasse l'empreinte de la plaque de base. Un rouleau ou un brayer est utilisé pour créer un joint étanche et uniforme entre le couvre-objet et l'espacement.

La plaque doit être inspectée à ce stade afin de s'assurer que la mise en place s'est déroulée correctement. Ce qu'on recherche est une apparence rappelant un œuf au plat dans une poêle. Dans chaque puits, le jaune de l'œuf correspond à la phase meza.

Le blanc d'œuf est la solution précipitante, et le bord de la poêle correspond au périmètre de la cristallisation. Idéalement, les trois sont concentriques. La plaque est désormais prête à être placée dans un espace de stockage à température contrôlée pour la croissance des cristaux.

Si aucune autre plaque n'est prévue, le bloc précipitant doit être retiré du plateau du robot, correctement scellé et remis en entrepôt. La seringue contenant le mease est retirée du bras de distribution du robot, puis démontée en ses différentes parties, notamment l'aiguille de distribution et le ferial. Elle est soigneusement lavée au méthanol et séchée en prévision de la prochaine utilisation dans le robot In Meso deux mosquito LCP.

Ce prochain extrait vidéo montre le robot LCP pour moustique qui peut être utilisé pour la mise en place d'essais de cristallisation in meso. Il intègre un système de distribution de phase similaire à celui décrit précédemment dans cet article. Pour le robot un, toutefois, le précipitant est distribué à l'aide de pointes jetables.

L'instrument lui-même est montré ici. Il comprend un plateau sur lequel sont placés la plaque de cristallisation et le bloc de précipitant, ainsi qu'une chambre munie de fenêtres pour le contrôle de l'humidité. Dans cette vue, les fenêtres de la chambre d'humidité sont ouvertes, ainsi qu'une bobine équipée de pointes de distribution, un bras de distribution, et un capteur à laser permettant de déterminer la position de l'aiguille de distribution de la phase méph.

Une plateforme surélevée sur laquelle repose la plaque de cristallisation et une plateforme encastrée destinée à contenir le bloc d'écrans de précipitant. Dans cette séquence, le robot effectue une série d'actions d'initialisation au démarrage de l'appareil. Un logiciel de programmation permet de configurer l'appareil pour travailler avec des plaques de cristallisation et des blocs de précipitants spécifiques, ainsi que de distribuer des volumes définis de solution mère et de précipitant selon une séquence prédéterminée.

De tels détails sont fournis par le fabricant et ne seront pas indiqués ici. L'utilisation du robot pour préparer une plaque de cristallisation commence comme suit : une seringue Hamilton complète, munie d'une aiguille et remplie de mèche chargée de protéine, est préparée comme décrit ci-dessus dans la section robot in meso un et dans Jo of 1 7 1 2. La seringue est fixée en place sous le bras de distribution du robot.

Les coordonnées X et Y de l'aiguille sur la seringue de distribution sont déterminées à l'aide du capteur laser monté sur le plateau. Cette étape importante est nécessaire pour garantir que la goutte est déposée précisément au centre de chaque puits de la plaque de cristallisation. En appuyant sur un bouton du panneau de commande, la seringue est amorcée afin d'expulser la goutte à l'extrémité de l'aiguille.

La mèche extrudée est ensuite retirée à l’aide d’un mouchoir en papier en vue de l’utilisation du robot pour charger les puits, avant de monter la plaque de cristallisation sur le plateau du robot. La surface du support est humidifiée avec quelques gouttes d’eau afin de maintenir la plaque en place. Par capillarité, le couvercle de protection est retiré de la plaque, puis celle-ci est placée fermement sur son support afin d’assurer une bonne adhérence.

Il y a trois repères sur la plateforme, centrés sous les trois puits d'angle, afin d'assurer un positionnement correct de la plaque par rapport à l'extrémité de l'aiguille de distribution. L'appareil est désormais prêt à entrer dans un cycle de configuration. Ce cycle commence par une deuxième étape d'amorçage, au cours de laquelle du Mease est distribué sur une petite plaque de verre, juste avant de passer au chargement de la plaque avec du Mease frais. Dans cette séquence, on voit le robot charger d'abord du Mease dans une colonne verticale de huit puits sur la plaque, puis utiliser des embouts jetables pour distribuer une solution de précipitant au-dessus du bolus de Mease.

Ce processus est répété 11 fois sur toute la longueur de la plaque jusqu'à ce que tous les puits soient remplis. L'ensemble du processus prend environ cinq minutes à compléter. Dans cette vidéo particulière, 50 nanolitres de Mease et 800 nanolitres de solution de précipitant ont été distribués dans chaque puits.

La plaque remplie est retirée de la plateforme du robot placée sur un banc. Le verre de couverture est appliqué et la plaque est scellée avec un soutien-gorge comme décrit ci-dessus sous le robot in miso un. La plaque correctement étiquetée peut maintenant être placée dans un environnement à température contrôlée pour la croissance des cristaux dans le Meso robot trois, le Griffin LCP.

Ce dernier extrait vidéo montre le robot Griffin LCP en cours d'utilisation lors de la mise en place d'essais de cristallisation en mésophase. Le Griffin intègre un système de distribution de phase mésophase similaire à celui décrit ci-dessus pour le robot un. Toutefois, dans ce cas, les 96 solutions de précipitant sont distribuées simultanément.

L'instrument lui-même est montré ici. Il comprend un plateau sur lequel sont placés la plaque de cristallisation et le bloc de précipitant, un bras de distribution et une tête de pipetage Phoenix 96. Pour la distribution des solutions de précipitant, le robot en action est montré dans cette dernière séquence vidéo.

La tête à 96 pointes est d'abord chargée avec la solution de précipitant. Un délai défini par l'utilisateur est prévu pour faciliter l'aspiration de précipitants visqueux. La phase MEA est distribuée séquentiellement dans les 96 puits selon un processus qui prend environ une minute à compléter.

Enfin, la tête à 96 embouts distribue simultanément les 96 solutions de précipitant au-dessus des bolus de phase MEA dans les puits de cristallisation. L'ensemble du processus de chargement de la plaque est achevé en deux minutes. La plaque remplie est retirée du plateau du robot, scellée avec un couvre-objet et placée en stockage dans des conditions de température contrôlées pour la croissance des cristaux.

Les prochaines étapes du processus global de détermination structurale par cristallographie macromoléculaire consistent à récolter les cristaux et à les refroidir par cryogénie, puis à enregistrer et à traiter la diffraction des rayons X qu'ils produisent. Ces sujets sont abordés dans des articles distincts de cette série.