Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle
9 janvier 2012
Bicelles sont des mélanges de lipides / amphiphile qui maintiennent les protéines membranaires (les députés) au sein d'une bicouche lipidique, mais ont un comportement de phase unique qui facilite criblage à haut débit par les robots de cristallisation. Cette technique a réussi à produire un certain nombre de structures à haute résolution provenant des deux sources procaryotes et eucaryotes. Cette vidéo décrit les protocoles pour générer le mélange lipidique bicelle, en incorporant les députés dans le mélange bicelle
Cette vidéo démontrera une méthode permettant de mettre en place des essais de cristallisation à haut débit de protéines membranaires purifiées à l'aide de cellules B Lipic. Premièrement, les cellules B sont préparées en mélangeant un lipide et un détergent ; la protéine membranaire purifiée est ensuite incorporée dans le mélange de cellules B, puis des essais de cristallisation sont réalisés à l'aide d'un robot nanolitre et d'un examen visuel. L'utilisation d'un microscope optique standard révèle la présence de cristaux.
Une fois formés, les cristaux protéiques peuvent être extraits et congelés pour la collecte de données et la détermination de la structure. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que, grâce au comportement de phase unique des cellules B, du matériel standard et des robots disponibles en laboratoire peuvent être utilisés pour la cristallisation. La mise en place des cellules B est une technique si simple qu'elle permet d'extraire votre protéine membranaire cible du milieu micellaire au détergent et de la placer dans un milieu lipidique.
Cela vous donne un ensemble entièrement nouveau de conditions à tester. Il s'agit d'une méthode si simple, utilisée avec succès sur de nombreuses protéines membranaires, qu'il n'y a aucune raison de ne pas l'essayer. La première étape de la cristallisation basée sur les cellules B consiste à préparer un mélange amphiphile lipidique formant des cellules B.
Ce processus exige des efforts considérables et est le plus long. Notez qu'il peut falloir plusieurs heures pour l'achever. Les cellules B peuvent se former dans diverses combinaisons d'amphiphiles lipidiques et sur une large gamme de concentrations.
Pour les points de départ suggérés, consultez le tableau un dans le protocole écrit accompagnant. Commencez par préparer un millilitre de mélange capso à 35 % de DMPC selon un rapport molaire de 2,8 pour un. Pour ce faire, pesez 0,26 gramme de DMPC et 0,09 gramme de Chapo dans un tube. Complétez le volume jusqu'à 1,0 millilitre à l'aide d'eau déionisée et vortexez le mélange.
Ensuite, réchauffez une solution à environ 40 degrés Celsius dans un bain-marie jusqu'à ce qu'elle devienne de consistance gélatineuse. Placez le tube sur de la glace. L'échantillon doit redevenir fluide.
Ensuite, vortexer à nouveau pendant quelques minutes, puis poursuivre les cycles de réchauffement, refroidissement et vortexage jusqu'à ce que le lipide soit complètement dissous. Notez que, à mesure que le nombre de cycles augmente, le mélange peut devenir trouble lors du refroidissement, une fois le processus terminé. Le mélange présentera un gel limpide à température ambiante ou supérieure, et un liquide visqueux sur glace ; les cellules peuvent être conservées à long terme à moins 20 degrés Celsius.
Ensuite, les protéines purifiées sont incorporées dans le milieu des cellules B. Ce processus est simple et doit être effectué le même jour que la cristallisation, comme illustré dans la section suivante de la vidéo. Dégeler le mélange de cellules B DMPC-capso à température ambiante jusqu'à ce que la phase devienne un gel transparent.
Placer le mélange sur de la glace pour le liquéfier, puis le vortexer brièvement afin de rétablir une phase homogène de lymphocytes B. À partir de ce moment, maintenir le mélange de lymphocytes B et la protéine purifiée sur de la glace. Cela maintiendra les lymphocytes B en phase liquide, ce qui permettra leur pipetage.
Ensuite, ajoutez le mélange de cellules B à la protéine purifiée solubilisée par détergent dans un rapport de un à quatre, volume à volume. Puis, pipetez doucement plusieurs fois de haut en bas jusqu'à ce que la solution devienne claire et homogène. Si des bulles apparaissent, faites-les brièvement tomber par une courte centrifugation dans une centrifugeuse de table.
Incubez le mélange sur de la glace pendant au moins 30 minutes pour favoriser l'incorporation complète de la protéine par les cellules. Le mélange de protéine et de cellules est désormais prêt pour les essais de cristallisation. Les essais de cristallisation seront démontrés à l'aide d'un robot de cristallisation mosquito.
Refroidissez une plaque à fond en V de 96 puits en la plaçant sur de la glace. Pipetez le mélange protéine-par-cellule dans la plaque afin de garantir que la viscosité de la solution soit minimale. Conservez le mélange protéine-par-cellule sur de la glace jusqu'à l'étape finale.
Le robot utilisé comporte cinq plateformes. Placer la microplaque contenant le réservoir sur la plateforme trois et le couvercle de cristallisation, sur lequel les gouttes seront dispensées, sur la plateforme cinq. Ensuite, placer la plaque de cellules contenant la protéine sur la plateforme quatre, la plus proche de la position de distribution.
Cela garantit que le mélange protéine-par-cellule est le dernier à être prélevé par le robot et qu'il est immédiatement relâché. À l'aide du logiciel, lancez l'exécution : le robot prélèvera d'abord la solution réservoir, puis le mélange protéine-par-cellule, et les dispensera sur le couvercle sous forme de gouttes afin d'éviter le chauffage et l'augmentation de la viscosité pendant le dosage. Ne programmez pas le mosquito pour mélanger le réservoir avec le mélange protéine-par-cellule dès la fin de l'exécution.
Retirez la plaque de protéine de cristallisation de l'appareil et placez-la sur de la glace. Retirez le couvercle de l'appareil et placez-le sur la plaque contenant la solution réservoir de sorte que les gouttes soient inversées. Incubez la plaque à 20 degrés Celsius.
Notez que d'autres températures peuvent également être testées pour la formation et l'optimisation des cristaux. Des températures plus élevées induisent la phase lamellaire, qui présente l'avantage de préorganiser la protéine en couches. Des températures comprises entre quatre degrés Celsius et 20 degrés Celsius peuvent être analysées.
Des températures inférieures à quatre degrés Celsius peuvent provoquer la précipitation des lipides sur des périodes prolongées ; effectuez une évaluation de l'apparition et de la croissance des cristaux au microscope optique standard le premier jour, le troisième jour, puis hebdomadairement par la suite. Sont présentées ici une image en champ clair et une image en ultraviolets de cristaux en forme d'aiguilles observés uniquement dans la condition de stress. Aucune fluorescence n'a été détectée à partir des cristaux, indiquant un faux positif sur cette image.
Un cristal en forme de bâtonnet s'est formé lorsque le méthylpropanediol a été utilisé comme précipitant. Le cristal fluoresce faiblement, ce qui suggère qu'il pourrait s'agir d'un cristal protéique, mais il s'est révélé non protéique par diffraction des rayons X. On observe ici un cristal environ quatre semaines après la mise en place des essais.
La forte fluorescence sous lumière UV confirme qu'il s'agit d'un cristal de protéine. Comme vous l'avez vu dans cette vidéo. Une fois les cellules B disponibles, elles peuvent être mélangées directement avec la protéine purifiée et, à partir de ce moment, la cristallisation se déroule presque exactement selon les protocoles standards à base de détergent.
Un autre avantage distinct réside dans la possibilité de doper les cellules B avec des lipides spécifiques à des fins d'optimisation. Cette technique offre une grande polyvalence et sa simplicité d'utilisation est telle qu'elle devrait être essayée pour tous les projets de cristallisation de protéines membranaires.
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Aperçu
Ce vidéo montre une méthode pour mettre en place des essais de cristallisation à haut débit de protéines membranaires purifiées en utilisant des bicelles lipidiques. La technique permet l'incorporation de protéines membranaires dans un milieu lipidique, facilitant ainsi le processus de cristallisation.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie structurale
- Crystallisation des protéines membranaires
- Biophysique
Contexte
- Les bicelles sont des mélanges de lipides et d'amphiphiles qui stabilisent les protéines membranaires au sein d'une bicouche lipidique.
- Cette technique présente un comportement de phase unique, avantageux pour le criblage à haut débit.
- Elle a permis avec succès d'obtenir des structures de haute résolution à partir de diverses sources.
- Un équipement de laboratoire standard peut être utilisé pour les essais de cristallisation.
Objectif de l'étude
- Montrer la préparation de bicelles pour la cristallisation de protéines membranaires.
- Expliquer comment incorporer des protéines membranaires dans le mélange de bicelles.
- Décrire les étapes de la mise en place d'essais de cristallisation.
Méthodes utilisées
- Préparation de bicelles par mélange de lipides et de détergent.
- Incorporation de protéines membranaires purifiées dans le mélange de bicelles.
- Essais de cristallisation réalisés à l'aide d'un robot nanolitre.
- Inspection visuelle des cristaux à l'aide d'un microscope optique standard.
Résultats principaux
- Formation réussie de cristaux de protéines à partir du mélange de bicelles.
- Les cristaux peuvent être extraits et congelés pour la collecte de données.
- La technique permet une utilisation efficace du matériel de laboratoire standard.
- Les capacités de haut débit améliorent le processus de cristallisation.
Conclusions
- Les bicelles constituent un milieu viable pour la cristallisation des protéines membranaires.
- La méthode simplifie le passage des protéines d'un environnement détergent à un environnement lipidique.
- Cette approche peut permettre une meilleure détermination structurale des protéines membranaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
La cristallisation des protéines membranaires demeure un goulot d'étranglement dans la découverte de médicaments basée sur la structure en raison de l'hydrophobicité des protéines et de leur instabilité dans les micelles de détergent. La méthode des bicelles lipidiques offre un environnement lipidique plus proche de l'état natif, améliorant ainsi la stabilité des protéines et la qualité des cristaux, permettant d'obtenir des données structurales fiables pour la validation des cibles. Cette approche soutient la réduction des risques mécanistiques en phase précoce en facilitant des analyses à haute résolution des poches de liaison des médicaments et des états conformationnels.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet la détermination de la structure de protéines membranaires dans un milieu lipidique qui préserve mieux la conformation native et les sites de fixation des ligands.
- Valeur opérationnelle : Réduit la dépendance à l’égard de criblages intensifs de détergents en fournissant une matrice lipidique standardisée pour les essais de cristallisation.
- Valeur prédictive : Des cristaux de haute qualité soutiennent une modélisation précise des interactions protéine-ligand, renforçant la fiabilité des hypothèses sur la liaison à la cible.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Produit des cristaux de qualité diffraction permettant une résolution au niveau atomique, essentielle pour la conception de médicaments assistée par la structure.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les robots standard de manipulation de liquides en nanolitre, permettant une intégration dans les pipelines existants de cristallisation à haut débit.
- Extensibilité : La faible viscosité des mélanges bicelles-protéines facilite la distribution automatisée et réduit les obstacles techniques à l'automatisation.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Les structures obtenues par cristallisation dans des bicelles informent la conception d'inhibiteurs sélectifs dotés de profils pharmacocinétiques améliorés.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet la visualisation des états conformationnels liés à la modulation allostérique et aux mécanismes de régulation.
- Pertinence pour les modèles précliniques : Soutient l'optimisation fondée sur la structure de candidats thérapeutiques ciblant des protéines membranaires associées à des maladies, provenant d'organismes variés.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode des bicelles s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible jusqu'à l'optimisation du composé précurseur, en fournissant des données structurales qui orientent la chimie médicinale et le choix du candidat préclinique.
- Découverte en biologie : Facilite la vérification d'hypothèses en permettant la visualisation de l'architecture des protéines membranaires et des sites de fixation des ligands dans un environnement lipidique proche de l'état natif.
- Écrantage : Génère des conditions de cristallisation compatibles avec l'écrantage robotisé, augmentant ainsi le débit et la couverture des conditions.
- Analytique : Fournit des données de diffraction aux rayons X permettant d'obtenir des cartes de densité électronique pour une construction précise des modèles et une validation des positions des ligands.
- Recherche translationnelle : Relie les structures atomiques à des tests fonctionnels, permettant de corréler l'affinité de liaison avec des perturbations structurales.
- Réutilisation en milieu industriel : Les formulations de bicelles peuvent être standardisées et conservées pour une utilisation répétée sur plusieurs cibles de protéines membranaires, réduisant ainsi la variabilité des réactifs.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Améliore le taux de réussite de la cristallisation des protéines membranaires en imitant l'environnement de la bicouche lipidique.
- Valeur opérationnelle : Utilise du matériel de laboratoire standard et de la robotique, éliminant ainsi le besoin d'outils spécialisés pour la manipulation des fluides à haute viscosité.
- Valeur stratégique : Accélère l'identification des candidats prometteurs en réduisant le délai d'obtention de la structure pour des cibles difficiles parmi les protéines membranaires.
- Impact sur le portefeuille : Permet de prendre des décisions fondées sur des données (aller ou ne pas aller plus loin) grâce à des informations structurales fiables sur la possibilité de cibler pharmacologiquement une protéine.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation des lipides et en biochimie des protéines membranaires afin d'optimiser les rapports lipide:détergent et l'incorporation des protéines.
- Dépend de l'accès à des robots de cristallisation et à des systèmes d'incubation à température contrôlée pour la mise en place et le suivi des essais.
- Exige une standardisation des protocoles de préparation des bicelles entre les équipes afin d'assurer la reproductibilité des résultats de cristallisation.
- Implique l'optimisation de la composition lipidique (par exemple, les rapports DMPC:CHAPSO) et le criblage de précipitants pour répondre aux besoins spécifiques de cristallisation de la protéine.
- Est limité par la nécessité d'une manipulation à froid pendant la préparation afin de maintenir la fluidité des bicelles et d'éviter des transitions de phase prématurées.
