Chromosomics: détection d'altérations numériques et structurelles dans les 24 chromosomes de l'homme en utilisant simultanément un dosage FISH Novel OctoChrome
6 février 2012
Un roman de fluorescence In situ (FISH) méthode qui examine simultanément à la fois des altérations chromosomiques numériques et structurelles, en particulier les translocations spécifiques chromosomiques associées à la leucémie et le lymphome, de tous les 24 chromosomes humains sur un seul appareil dans une hybridation, est décrite.
Le test Octa Chrome Fish examine simultanément tous les 24 chromosomes humains lors d'une seule hybridation sur une lame. Préparez d'abord des préparations métaphasiques sur la lame spécifique à huit carrés. Ensuite, effectuez un balayage automatisé de la lame échantillon afin de faciliter la localisation de toutes les métaphases et la réévaluation ultérieure de toutes les images cellulaires.
Position suivante : les huit carrés glissent sur le dispositif Octa chrome et hybrident les sondes. Les résultats obtenus peuvent montrer trois chromosomes entiers colorés différemment dans chaque carré, selon l'arrangement des combinaisons chromosomiques sur le dispositif RO. J'ai eu pour la première fois l'idée de cette méthode de FISH RO lorsque j'ai commencé à appliquer la FISH à l'étude des populations humaines au début des années 1990.
Ensuite, j'ai présenté mon idée de peinture en triple couleur, une diapositive carrée à huit puits, lors de la conférence annuelle de l'A A CR en 1994. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la courbure classique des chromosomes et le prototypage spectral moderne, est qu'elle permet d'analyser facilement l'ensemble des 24 chromosomes humains dans un plus grand nombre de cellules. Commencez par préparer des cellules en métaphase fixées en suspension : déposez à l’aide d’une pipette une goutte de cellules sur une lame et vérifiez la densité appropriée.
Plongez maintenant dans huit carrés au chrome OC, puis faites glisser dans de l'éthanol pur pendant deux minutes. Sur une séquence de carrés alternés, répartissez cinq microlitres de suspension cellulaire sur la lame-matrice afin d'éviter que les étalements cellulaires n'interfèrent les uns avec les autres. Laissez sécher à l'air les échantillons avant de déposer des paires adjacentes.
Appliquez 20 microlitres de colorant DAPI à 0,2 microgramme par millilitre au centre de chaque moitié de la lame, puis placez une lamelle. Effectuez ensuite une analyse automatisée de la lame d'échantillon pour localiser les cellules en métaphase. Utilisez le logiciel metaverse pour faciliter la localisation de toutes les métaphases et la réévaluation ultérieure de toutes les images cellulaires.
Examinez manuellement les résultats de numérisation et supprimez les artefacts non métaphasiques. Éliminez d'abord la coloration DPI dans deux tampons XSSC, puis déshydratez les échantillons par une série de lavages à l'éthanol. Laissez sécher la lame à l'air, puis placez-la sur une plaque chauffante à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Équilibrez maintenant la sonde chroma, la chambre d'hybridation à sonde multiple et le tampon d'hybridation dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, le côté étiquette vers le bas. Placez l'appareil OC chrome sur une plaque chauffante à 37 degrés Celsius. Ajoutez deux microlitres de solution d'hybridation préchauffée à chacune des huit zones.
Retournez et orientez soigneusement le gabarit. Faites-le glisser sur le dispositif Octa Chrome. Vérifiez que le diapositive du gabarit est aligné avec le dispositif Octa Chrome.
Abaissez ensuite délicatement la lame sur les gouttes de solution d'hybridation et appliquez une pression douce et uniforme pour répartir la solution d'hybridation jusqu'aux bords de chacune des zones surélevées du dispositif en chrome OC. Soulevez par l'extrémité dépolie de la lame de verre et retournez-la afin que la lame se retrouve sous le dispositif en chrome OC. Placez l'ensemble sur une plaque chauffante à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Ensuite, transférez-le sur une plaque chauffante à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour dénaturer les échantillons en vue de l'étape d'hybridation, transférez-les dans une chambre d'hybridation Chroma Probe, Multi Probe. Remplacez le couvercle et laissez flotter la chambre dans un bain-marie à 37 degrés Celsius toute la nuit.
Retirer délicatement la lame de l'appareil et la laver dans 0,4 volume excès de SC à 72 degrés Celsius pendant deux minutes. Effectuer le deuxième lavage à température ambiante pendant 30 secondes. Passer ensuite à l'ajout de 20 microlitres de DPI au centre de chaque moitié de la lame et positionner une lamelle.
Incubez les échantillons à l'abri de la lumière pendant 10 minutes à température ambiante avant de les observer en microscopie de fluorescence. Le test Octa chrome fish permet l'examen simultané de l'ensemble des 24 chromosomes humains à l'aide d'une seule hybridation sur une lame unique. Chaque carré contient trois sondes de peinture chromosomique entière différentes, marquées directement avec des fluorochromes de couleurs distinctes.
L'examen de quatre cellules métaphasiques normales dans le carré deux du système Octa CHRO montre que les chromosomes 8, 21 et 12 sont colorés en rouge, vert et bleu. Ils peuvent être visualisés individuellement à l'aide de filtres spécifiques ou simultanément à travers un triple filtre DAPI Fitzy, Texas Red. Cette approche chromosomique présente une utilité dans la détection de cellules anormales portant des translocations chromosomiques spécifiques aux leucémies ainsi que des aneuploïdies.
Par exemple, la translocation chromosomique T 8 21 est fréquente dans la leucémie myéloïde aiguë. La trisomie 21 — trois copies du chromosome 21 — est une aneuploïdie courante dans la leucémie après le développement. Cette technique a permis aux scientifiques spécialisés en cytogénétique moléculaire et en épidémiologie moléculaire d'explorer les réarrangements chromosomiques les plus fréquemment détectés dans la leucémie et le lymphome, ainsi que d'examiner la ploïdie sélective parmi tous les chromosomes humains chez des patients cliniques ou des populations exposées à des produits chimiques toxiques.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'examiner simultanément tous les 24 chromosomes humains en une seule hybridation sur une lame unique grâce au test Octo Chrome Fish. Et nous définissons cela comme des chromosomes.
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Aperçu
Cet article décrit une nouvelle méthode d'hybridation in situ en fluorescence (FISH) appelée le test Octa Chrome Fish. Elle permet l'examen simultané des 24 chromosomes humains en une seule hybridation sur une lame, en se concentrant sur les altérations chromosomiques associées à la leucémie et au lymphome.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Hybridation in situ en fluorescence (FISH)
- Analyse chromosomique
- Oncologie
Contexte
- La FISH est une technique utilisée pour détecter et localiser la présence ou l'absence de séquences d'ADN spécifiques sur les chromosomes.
- Les translocations chromosomiques revêtent une importance particulière dans l'étude des leucémies et des lymphomes.
- La méthode permet une analyse complète des altérations chromosomiques.
- Les méthodes antérieures nécessitaient plusieurs hybridations, ce qui rend cette approche plus efficace.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode qui simplifie la détection des anomalies chromosomiques.
- Améliorer l'efficacité de l'analyse chromosomique en milieu clinique.
- Fournir un outil permettant de mieux comprendre la base génétique des malignités hématologiques.
Méthodes utilisées
- Préparation de préparations métaphasiques sur une lame spécialisée à huit carrés.
- Analyse automatisée de la lame pour localiser les métaphases destinées à l'analyse.
- Hybridation des sondes à l'aide du dispositif Octa Chrome.
- Visualisation des résultats montrant les différents chromosomes entiers colorés selon leurs arrangements.
Résultats principaux
- Le test parvient à visualiser l'ensemble des 24 chromosomes lors d'une hybridation unique.
- Les résultats peuvent afficher trois chromosomes marqués différents dans chaque case de la lame.
- Permet la réévaluation des images cellulaires en vue d'une analyse complète.
- Démontre un potentiel d'application dans les études de populations humaines.
Conclusions
- Le test Octa Chrome Fish représente une avancée significative dans la méthodologie FISH.
- Cette méthode peut améliorer la détection des anomalies chromosomiques dans les cancers hématologiques.
- Elle offre une approche plus efficace aux chercheurs et aux cliniciens.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Le test OctoChrome-FISH permet la détection simultanée des anomalies chromosomiques numériques et structurelles portant sur l'ensemble des 24 chromosomes humains lors d'une seule hybridation, répondant ainsi à un goulot d'étranglement majeur dans l'analyse cytogénétique des hémopathies malignes. En regroupant le criblage du génome entier en un seul protocole basé sur une lame, il améliore le débit et la reproductibilité dans la recherche sur les leucémies et les lymphomes, facilitant la validation précoce des cibles et la réduction des incertitudes mécanistiques en découverte préclinique. Cette capacité renforce la fiabilité prédictive dans l'identification des oncogènes induits par des translocations et des profils d'aneuploïdie associés à la leucémogenèse induite par le benzène et d'autres expositions à des agents toxiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en visualisant des translocations spécifiques aux leucémies telles que t(9;22), t(15;17), t(8;21) et t(14;18) dans leur contexte chromosomique d'origine.
- Valeur opérationnelle : Réduit le besoin de plusieurs hybridations FISH séquentielles, préservant ainsi les échantillons et accélérant la confirmation des cibles en biologie de la découverte.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en permettant une évaluation concomitante des réarrangements structuraux et de l'aneuploïdie à l'échelle du génome, renforçant ainsi la confiance dans les associations entre cibles et maladies.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes chromosomiques validés pour des criblages ultérieurs en établissant des caryotypes de référence et en détectant les taux d'altération de fond dans les populations exposées.
- Valeur opérationnelle : Standardise les lectures cytogénétiques grâce à un marquage homogène des sondes et une architecture de lame cohérente, améliorant ainsi la reproductibilité entre laboratoires et campagnes de criblage.
- Valeur en termes d'évolutivité : Permet une analyse à haut contenu des métaphases par numérisation automatisée, facilitant la réévaluation et le suivi longitudinal de la stabilité chromosomique dans les études toxicologiques longitudinales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Fait le lien entre la découverte et la validation préclinique en permettant la comparaison directe des altérations chromosomiques dans les modèles cellulaires, les échantillons de patients et les cohortes de population exposées à des leucémogènes comme le benzène.
- Réduction du risque mécanistique : Précise si les aneuploïdies ou translocations observées sont des événements aléatoires ou des profils liés à l'exposition, ce qui éclaire l'évaluation des risques dans le développement de biomarqueurs translationnels.
- Valeur de continuité : Permet une transition fluide des résultats in vitro vers leur pertinence in vivo en maintenant une résolution chromosomique constante entre les systèmes modèles et les spécimens humains.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique, permettant une analyse chromosomique aux premiers stades de la vérification des hypothèses et soutenant l'identification de candidats prometteurs grâce à la réduction des risques mécanistiques liés à l'instabilité génomique.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur les mécanismes chromosomiques de la leucémogenèse en assurant un dépistage simultané de multiples anomalies connues et nouvelles à travers le génome.
- Dépistage : Fournit des résultats quantitatifs multiplexés (par exemple, fréquence des translocations, taux d'aneuploïdie) permettant de comparer les effets de composés ou d'expositions selon différentes conditions.
- Analyse : Génère des signaux fluorescents multiplexés compatibles avec l'imagerie automatisée et le caryotypage assisté par logiciel, permettant une comparaison objective des états chromosomiques.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les résultats in vitro et leur pertinence chez l'humain en détectant des profils chromosomiques identiques dans des études de population, soutenant ainsi l'harmonisation des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une plateforme cytogénétique réutilisable, applicable dans divers programmes d'oncologie, de toxicologie et de pharmacogénomique nécessitant une évaluation de l'intégrité chromosomique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant les faux négatifs grâce à une couverture chromosomique complète.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité par l'utilisation d'ensembles de sondes et d'un format de lame normalisés, réduisant ainsi la variabilité entre laboratoires.
- Valeur stratégique : Renforce l'efficacité du capital en diminuant la consommation de réactifs et le temps de manipulation par rapport aux approches FISH ou SKY séquentielles.
- Impact sur le portefeuille : Permet des décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant dès les premiers stades des preuves de stabilité ou d'instabilité génomique chez les candidats principaux.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie à fluorescence et en préparation cytogénétique pour générer correctement des métaphases étalées et interpréter les signaux.
- Dépend de l'accès au dispositif OctoChrome et à des chambres d'hybridation compatibles permettant la livraison simultanée de plusieurs sondes.
- Exige une standardisation des protocoles de manipulation des lames, de dénaturation et de lavage afin d'assurer une pénétration homogène des sondes et des rapports signal/bruit constants.
- L'adaptation à des systèmes modèles non humains peut nécessiter une nouvelle validation de la spécificité des sondes et de l'efficacité de la coloration chromosomique.
- Les limitations pratiques incluent la dépendance à des échantillons de qualité métaphasique et le risque de chevauchement des signaux dans les génomes fortement réarrangés, ce qui exige un déconvolution spectrale minutieuse.
