Production, de conditionnement, et la caractérisation des cellules invasives Espèces protéine DISC1

L'objectif général des procédures suivantes est de produire des disques purifiés. Un agrégat capable d'envahir les cellules réceptrices. Deux méthodes différentes permettant d'atteindre cet objectif seront démontrées avec la première méthode.

La protéine fluorescente formant un assemblage, fusionnée à la protéine disque une, est surexprimée dans des cellules donneuses humaines de neuroblastome NLF. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS, collectées et lysées sans utilisation de détergents. L'ADN est digéré et les agrégats sont purifiés à l'aide d'un système de gradient de saccharose.

Les Agrios purifiés par cette méthode présentent une faible efficacité d'invasion cellulaire. L'approche alternative consiste à surexprimer les acides aminés 598 à 785 de la protéine recombinante disc une dans E. coli. Le fragment protéique est ensuite marqué avec le DITE 594, dialysé et purifié à l'aide d'une matrice NI NTA, ce qui élimine tout colorant non lié et tout disc multimerique résiduel.

Les fragments un générés par cette méthode présentent une forte efficacité d'invasion cellulaire permettant d'évaluer l'invasion des cellules hôtes. Soit le disque purifié de protéine fluorescente, les un risomes ou le disque recombinant marqué. Le fragment un est incubé avec les cellules réceptrices d'intérêt.

Le bleu de Trian est ensuite ajouté pour éteindre la fluorescence extracellulaire, et l'envahissement est visualisé par microscopie confocale. Jusqu'à présent, l'agrégation protéique n'a pas été reconnue comme une caractéristique des maladies mentales chroniques telles que la schizophrénie. Lorsque la protéine disruptée dans la schizophrénie 1 est un facteur candidat d'envahissement cellulaire, les agrégats protéiques constituent une caractéristique distinctive des maladies à mauvais repliement protéique.

Ici, nous montrons par deux méthodes que les agrégats de la protéine disc une sont envahissants pour les cellules, et que par conséquent les troubles liés au disc une ou les neuropathies associées au disc une sont des troubles conformationnels des protéines. Ces deux méthodes consistent d'abord à la purification du disc complet, un ASOS provenant de lignées cellulaires de neuroblastome, puis à l'expression d'un fragment multimérique du disc une au niveau de l'extrémité C-terminale dans E. coli, ainsi qu'à la purification et au marquage avec un colorant fluorescent.

Bien que la première méthode ne conduise qu'à une faible efficacité d'envahissement cellulaire d'environ 0,3 % des cellules ayant intégré les microsomes purifiés, le fragment protéique recombinant pur infecte jusqu'à 20 % des cellules exposées. Les méthodes décrites ici devraient être transposables à d'autres protéines pour lesquelles la formation de l'acrosome ou l'assemblage multimérique a été clairement démontrée. Dans chacune des 10 boîtes de 10 centimètres.

Ensemencer 1,5 × 10⁶ cellules de neuroblastome humain et cellules LF dans un milieu RPMI 1640 complémenté et faire croître pendant la nuit. Le jour suivant, les cellules doivent être confluentes à 70 à 80 % ; étiqueter cinq boîtes pour la transfection avec PC DNA 3.1 MRFP et EGFP marqué, ainsi que le gène humain complet disc un, et cinq autres pour la transfection avec le plasmide EGFP seul. Pour chaque boîte de 10 centimètres, combiner 15 microgrammes d'ADN plasmidique, 30 microlitres de réactif de transfection et 750 microlitres.

Opti MEM dans un tube de microcentrifugeuse et mélanger en pipettant par aspiration et expulsion répétées, puis incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, pour transfecter les cellules, ajouter la solution de réactif de transfection d'ADN goutte à goutte sur les cellules, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 %CO₂. 48 heures après la transfection, surveiller l'expression de MRFP intégral disc un et confirmer la formation de zones agro sous un microscope à fluorescence. Certaines cellules contiennent de grandes inclusions de protéines fluorescentes, comme illustré ici.

Ce protocole combine une méthode de purification des corps de Lewy à partir de tissu cérébral et le protocole d'isolement des agrégats plus gros ou des zones agro, car les méthodes déjà existantes reposent sur l'utilisation de détergents, alors que l'isolement de protéines sans détergent est essentiel pour leur utilisation dans des tests d'invasivité cellulaire. Ensuite, aspirez le milieu, rincez avec du PBS et ajoutez 400 microlitres de PBS contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases. Puis grattez les cellules et ajoutez un millilitre de suspension cellulaire ainsi que 10 billes en céramique dans un tube de lyse de deux millilitres.

Lyserez les cellules à l'aide de trois impulsions de 62 secondes sur un homogénéisateur préalablement réglé sur la lyse cellulaire 24. La force mécanique du processus peut augmenter la température à l'intérieur de l'échantillon à plus de 37 degrés Celsius. Il convient donc de prendre soin de refroidir l'échantillon sur de la glace. Après la procédure de lyse, une fois les cellules refroidies sur de la glace, ajoutez du chlorure de magnésium à 10 millimolaire et 40 unités par millilitre d'ADNase, puis incubez pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius sous agitation.

Préparez 10 millilitres chacun de solutions de saccharose à 80 %, 50 % et 20 % poids par volume dans du PBS. Ensuite, dans un tube conique de 15 millilitres, préparez le gradient de saccharose en commençant par deux millilitres de saccharose à 80 %, suivis de deux millilitres de saccharose à 50 % et de deux millilitres de saccharose à 20 %. Versez le gradient lentement et faites attention à ne pas perturber les couches déjà ajoutées.

Superposez ensuite le lysat digéré sur le gradient et centrifugez pendant 15 minutes à 1000 × g à quatre degrés Celsius. Après la rupture, collectez soigneusement l'interface entre les couches de saccharose à 50 et 80 % à l’aide d’une pipette et mélangez avec cinq volumes dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez pendant 15 minutes à 1000 × g à quatre degrés Celsius. Retirez soigneusement le surnageant et conservez le culot contenant la zone d’aggrégation.

Répétez le lavage deux fois supplémentaires à cette interface. Les zones Agri sont fluorescentes et peuvent être visualisées au microscope sous lumière UV après le dernier lavage ; éliminez le surnageant et resuspendez le culot dans 250 à 500 microlitres de PBS. Ce culot contient les zones agro purifiées.

Ajouter 10 µL de disque MRFP, une suspension d'asomes, dans chaque puits d'une plaque à 24 puits contenant des cellules de neuroblastome humain SHSY-5Y, exprimant de façon constitutive un GFP soluble relié par son extrémité C-terminale à un disque sur des lamelles de verre stériles, et incuber pendant 48 à 72 heures. Après l'incubation, laver les cellules trois fois avec du PBS et éteindre la fluorescence extracellulaire avec du bleu de trypan à 0,04 % pendant cinq minutes.

Ensuite, lavez à l'aide de PBS pour éliminer le bleu de trian. Puis, placez la boîte sur de la glace et ajoutez du PFA 4 % dans du PBS pendant 10 minutes pour fixer les cellules. Lavez ensuite une fois avec de l'eau stérile et montez les lamelles sur des lames de verre à l'aide du milieu de montage Prolong Gold avec DPI.

Confirmer l'absorption lors de l'invasion de manière exogène. Appliquer les zones d'agression par colocalisation avec les protéines recrutées exprimées par les cellules réceptrices sur les images Zack. Ce Zack englobe environ six micromètres en profondeur.

24 images capturés par pas de 200 nanomètres. La fluorescence du disque MRFP d'une zone agri, montrée en rouge, recrute le terminus cytosolique GFPC du disque. Une colocalisation d'un fragment, montrée en vert, apparaît en jaune et indique que les zones agri sont entrées dans le cytosol du receveur et ont recruté la protéine du disque un, auparavant soluble.

Dans cette partie du protocole, le disque humain un sera marqué avec le DITE 5 94. Ce D permet la surveillance directe de la protéine recombinante sans nécessiter une coloration immunohistochimique supplémentaire. Commencez par éliminer le mercaptoéthanol du beam du prélèvement protéique préparé comme décrit dans le document accompagnant, en le dialysant trois fois dans deux litres de PBS à une dilution de un à 2000.

À côté de l'étiquetage d'un disque de un milligramme avec DITE 5 94 IDE, dissoudre un milligramme par millilitre de protéine dans du PBS et ajouter du TCEP à cinq millimolaire pour récupérer les groupes SH libres ; ajouter 20 microlitres du colorant dissous dans du DMF à la réaction et incuber deux heures à température ambiante. À l'aide d'une cassette de dialyse SLI ayant une coupure de poids moléculaire de 10 000 daltons, dialyser la protéine trois fois dans du PBS selon un rapport de un à 2000, chaque dialyse durant deux heures. Ensuite, pour augmenter davantage la pureté de la protéine marquée.

Une purification par affinité basée sur une étiquette hiss est réalisée sur une colonne NI NTA. Lavez un millilitre de matrice NI NTA avec 10 millilitres de PBS, puis appliquez la protéine dialysée marquée sur la colonne et laissez-la s’écouler à travers la colonne.

Progressivement, la solution perdra une partie de sa couleur bleue en raison de la liaison de la protéine à la matrice NTA ; le colorant libre non marqué restera dans l'écoulement. Une fois la solution protéique introduite, lavez la colonne trois fois avec 20 millilitres de PBS pour éluer la protéine, puis ajoutez deux millilitres de PBS contenant 500 millimolaire d'ole à la colonne.

Régler la valve à faible vitesse et éluer goutte à goutte tout en surveillant la bande colorée sur la colonne N NI NTA. Pour être précis, cette fraction colorée de l’éluat contient une protéine recombinante marquée ; transférer l’EIT dans une cassette de dialyse SLI et dialyser l’EIT trois fois contre du NAPI 10 millimolaire à une dilution de un à 2000, deux heures à chaque fois, dans deux litres. Après dialyse, faire passer l’EIT à travers un filtre stérile de 0,45 micromètre monté sur une seringue, puis aliquoter en cinq échantillons de 100 microlitres et congeler rapidement dans l’azote liquide.

La quantité totale de protéine doit être comprise entre 0,5 et un microgramme par millilitre dans chaque aliquot de 100 microlitres. Pour évaluer l'invativité de la protéine, ajouter du milieu contenant cinq à 10 microgrammes par millilitre de la protéine recombinante marquée disc one à chaque puits d'une plaque de 24 puits contenant des cellules de neuroblastome humain SH SY 5 Y réceptrices. Expresant constitutivement la balise GFP soluble au niveau du terminus C de disc one sur des lamelles de verre stériles, incuber pendant 48 à 72 heures.

Éteignez la fluorescence extracellulaire, fixez et montez les cellules comme pour les cellules traitées par la zone agri, puis confirmez l'internalisation de la protéine recombinante exogène appliquée par imagerie Zack. Lorsque la protéine marquée est internalisée, elle est détectée à l'intérieur du périmètre des cellules réceptrices sur les images obtenues par microscopie confocale. Ce Zack couvre une profondeur d'environ cinq micromètres en 24 pas de 220 nanomètres.

Ici, le fragment recombinant de disc un, de 598 à 785, représenté en rouge, est internalisé par des cellules réceptrices exprimant la forme soluble de disc un, marquée par GFP à l'extrémité C-terminale, représentée en vert, afin de déterminer l'invasivité de la protéine disc un. Des agrégats de protéine disc un entière, marqués par MRFP, provenant de zones acrosomiques ont été purifiés à partir de cellules NLF et appliqués sur des cellules réceptrices SH-SY5Y, comme décrit dans cette photographie. L'acrosome de disc un marqué par A-M-R-F-P a pénétré une cellule de neuroblastome humain SH-SY5Y exprimant la forme soluble de disc un marquée par GFP à l'extrémité C-terminale.

De plus, le disque un marqué par le MRFP a été capable de recruter le disque un soluble marqué par la GFP en agrégats insolubles afin de déterminer l'invasivité du disque un recombinant marqué par le DIA. Ce dernier a été appliqué à des cellules de neuroblastome SH-SY5Y exprimant le disque un soluble marqué par la GFP, comme indiqué ici. La protéine recombinante disque un, visualisée en rouge, a pénétré dans la cellule receveuse ; les points jaunes indiquent le recrutement du fragment C-terminal du disque un marqué par la GFP soluble en agrégats. Le disque un recombinant marqué et exprimé, puis purifié à partir d’E. coli, s’est également révélé invasif pour les neurones in vivo lorsque la protéine multimérique a été injectée stéréotaxiquement dans le cortex préfrontal médian d’un rat. L’imagerie Zack confirme la présence de la protéine recombinante disque un dans les neurones corticaux du rat, mis en évidence par un anticorps dirigé contre les noyaux neuronaux.

Nous venons de vous présenter deux méthodes permettant de générer des agrégats de la protéine disc une pour l'étude de l'invasion cellulaire. À l'aide de l'une ou l'autre de ces méthodes, nous pouvons examiner les effets cellulaires liés à l'absorption d'agrégats de disc une, sans les variables potentiellement perturbantes que constitue l'expression de gènes recombinants par transfection d'ADN étranger. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier in vitro les effets biologiques de la pathologie protéique de disc une dans les cellules, ainsi qu'in vivo par inoculation intracérébrale ou toute autre administration dans des modèles animaux.

Nous sommes convaincus que ces techniques pourraient également être transférées à d'autres agrégats protéiques, éventuellement avec de légères modifications du protocole adapté à chaque protéine particulière. Lors de la réalisation de cette procédure, veillez à consacrer suffisamment de temps à l'analyse rigoureuse des images de microscopie confocale.