Mesure quantitative de la réponse immunitaire et le sommeil en

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer le sommeil et la fonction immunitaire chez la drosophile. Cela est d'abord réalisé en enregistrant l'activité locomotrice des mouches infectées afin de mesurer le sommeil, puis, dans une deuxième étape après l'infection, les mouches sont homogénéisées, diluées et étalées sur des géloses LB. Le nombre d'unités formant des colonies qui se développent indique la capacité des mouches à éliminer l'infection.

Ensuite, des mouches infectées exprimant un transgène contenant le rapporteur NF kappa b luciférase sont ajoutées à une plaque de 96 puits contenant la luciférine, le substrat de la luciférase. La mesure en temps réel de la luciférase kappa b indique l'activation d'une voie de signalisation NF kappa B pendant l'infection, ainsi que le résultat sur la survie et le sommeil. L'élimination bactérienne et l'activité du rapporteur NF KB sont des mesures qui fournissent des éclaircissements mécanistiques sur le lien moléculaire entre la fonction immunitaire et le comportement.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car il faut du temps et de la pratique pour apprendre à infecter manuellement les mouches de manière reproductible. Le principal avantage de la technique utilisant le rapporteur luciférase par rapport aux méthodes existantes, telles que la QPCR, est que l'activité du facteur nucléaire kappa B peut être mesurée en continu, en temps réel, chez des mouches vivantes. Commencez par incuber des cultures de drosophiles au stade pupal tardif pendant trois à quatre jours, afin que les adultes s'adaptent aux conditions environnementales.

Ici, les mouches sont placées en lumière constante afin d'éliminer l'influence de l'horloge circadienne sur la réponse immunitaire et le comportement. Ensuite, chargez des mouches âgées d'un à quatre jours dans l'appareil de suivi d'activité. Les moniteurs enregistrent leur activité pendant au moins trois jours avant l'infection, soit un jour avant l'infection programmée.

Prélevez une colonie SIA unique à l’aide d’une pointe de pipette stérile et immergez la pointe dans un tube de culture contenant cinq millilitres de milieu LB afin de vérifier la technique stérile. N’oubliez pas de préparer une culture témoin sans bactérie. Faites croître les bactéries toute la nuit jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase de croissance exponentielle le lendemain.

Mesurez l'absorbance de la culture à 600 nanomètres. Incluez un second Q vet comme témoin. La culture est prête lorsque la concentration se situe entre 0,5 et 1 unité d'absorbance ; effectuez alors un sous-culture ou prolongez le temps de culture selon les besoins.

Préparez maintenant la solution bactérienne pour infecter les mouches. Diluez les bactéries avec du PBS pour obtenir une absorbance attendue de 0,1 à 600 nanomètres. Ajoutez ensuite un colorant alimentaire comme témoin d'injection.

Remplacez les bactéries par du milieu LB. Conservez les deux solutions sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’un tireur de micropipettes, fabriquez des aiguilles d’injection avec une pointe fine sous un microscope stéréoscopique.

Utilisez une pince fine pour briser la pointe de chaque aiguille afin que l'ouverture soit suffisamment grande pour être remplie de liquide d'injection par aspiration, mais suffisamment petite pour minimiser les dommages causés à la drosophile. Fixez une aiguille en verre à une seringue en plastique de trois cm³ à l'aide d'un morceau de tubulure en utilisant la seringue. L'écoulement du milieu d'injection est contrôlé manuellement.

Évitez de contaminer le tube en caoutchouc avec le liquide d'injection, car l'appareil à seringue est utilisé à la fois pour les injections infectieuses et les injections témoins. Vérifiez l'écoulement du milieu d'injection à l'aide d'un mouchoir en papier Kim. Deux éléments essentiels pour des injections réussies sont l'utilisation de la taille optimale d'aiguille et l'étanchéité sécurisée entre l'aiguille et la seringue.

Une fois le système d'injection entièrement préparé, anesthésiez les mouches à l'aide d'un débit minimal de dioxyde de carbone, puis procédez rapidement afin qu'aucune mouche ne soit anesthésiée plus de cinq minutes. Injectez maintenant les mouches en piquant l'aiguille en verre dans la région située au-dessus du scutellum du thorax dorsal. L'entrée du milieu d'injection dans la mouche est confirmée par le colorant alimentaire, visible lorsque la solution injectée se répand.

Avant de commencer, assurez-vous que tous les matériaux utilisés pour cette procédure ont été stérilisés au autoclave au moins un jour à l'avance. Préparez des boîtes de Pétri de 10 centimètres avec du milieu gélosé LV. Le jour de l'expérience, anesthésiez et placez les mouches dans des tubes de centrifugation de 1,5 millilitre.

Préparez au minimum deux groupes de 10 mouches chacun par condition expérimentale. Préparez également un groupe témoin de mouches non infectées, en particulier lors de l'utilisation d'une souche bactérienne sans résistance aux antibiotiques. Conservez tous les tubes chargés sur de la glace.

Ensuite, ajoutez 400 microlitres de milieu LB dans chaque tube contenant des mouches. Homogénéisez les mouches à l’aide d’un petit broyeur, en travaillant près d’une flamme pour éviter toute contamination. Puis, à l’aide de pointes de pipette coupées, effectuez des dilutions sérielles de l’homogénat par facteurs de 10 dans des volumes de 200 microlitres.

Si l'homogénat est préparé immédiatement après l'infection avec sia, effectuez des dilutions allant jusqu'à un sur 1000, mais pour l'homogénat prélevé 24 heures après l'infection, effectuez des dilutions allant jusqu'à un sur 100 000. Ensuite, ensemencez les deux plus fortes dilutions sur des boîtes de 10 centimètres à l'aide de billes de verre afin d'assurer une répartition uniforme, puis incubez les boîtes pendant la nuit. Le lendemain, comptez le nombre de colonies sur la boîte par observation directe ou à l'aide d'un logiciel de comptage de colonies.

Ensuite, calculez le nombre d'unités formant des colonies par mouche. Cet essai utilise des mouches transgéniques portant le rapporteur luciférase kappa b au moment approprié. L'essai nécessite également des bactéries cultivées, telles que SCIA, préparées pour injection comme décrit dans la section précédente.

Ajustez les mouches aux conditions d'éclairage expérimentales. Dans cet exemple, des mouches transgéniques exprimant la luciférase kappa b âgées d'un à quatre jours sont élevées dans des flacons contenant un milieu alimentaire composé de 5 % de saccharose et de 2 % d'agar, puis placées en lumière constante pendant deux jours. Préparez maintenant une microplaque de 96 puits pour les mouches.

Remplir chaque puits de deux couches d'aliment. Ajouter d'abord le milieu, puis 300 microlitres de solution de 5 % de saccharose et 2 % d'agar dans chaque puits. Recouvrir ensuite la plaque d'un tissu fin en maille et laisser sécher complètement pendant une heure maximum.

Ensuite, ajoutez une couche supérieure de 50 microlitres dans chaque puits contenant 5 % de saccharose, 1 % d'agar et deux millimolaires de Lucifer. Étant donné que le Lucifer est sensible à la lumière, laissez sécher la plaque à l'obscurité à partir de maintenant. Minimisez l'exposition de la plaque à la lumière.

Une fois que l'agar a refroidi, recouvrez la boîte avec un film adhésif transparent. Ensuite, à l'aide d'une aiguille fine, percez le film deux fois au-dessus de chaque puits. Ces trous permettent les échanges gazeux et l'anesthésie par voie aérienne.

Ensuite, pour faciliter le chargement des mouches, utilisez une lame bien aiguisée et une règle droite afin de pratiquer une incision entre chaque colonne. Anesthésiez les mouches au dioxyde de carbone et chargez-les une par une dans chaque puits, colonne par colonne. Si une mouche reste collée au film, laissez-lui la possibilité de se libérer avant d'intervenir.

Replacer la plaque de microplaque dans l'incubateur sous lumière constante pendant huit à 24 heures. Pour anesthésier les mouches fixées dans les puits, utiliser une pointe de micropipette reliée à une ligne de dioxyde de carbone à basse pression. S'assurer que le gaz est à une pression suffisamment faible pour être inoffensif et placer la pointe de micropipette directement au-dessus des trous de ventilation pour anesthésier les mouches, huit par huit, individuellement.

Transférez chaque mouche sur un coussin de CO2 et infectez-les avec des bactéries comme précédemment. Replacez ensuite chaque mouche dans son puits d'origine et refermez hermétiquement la microplaque. Mesurez la luminescence de chaque mouche à l’aide d’un luminomètre placé dans une pièce à température contrôlée et soumise à un cycle lumineux défini.

Chargeez les plaques dans la cassette empilable, en veillant à placer les plaques contenant les mouches entre des plaques vierges transparentes. Programmez le luminomètre conformément aux spécifications du fabricant et enregistrez les mesures toutes les heures pendant au moins 24 heures. Dans cet exemple, les détecteurs sont programmés pour lire chaque puits pendant 10 secondes.

Une fois terminé, exportez les fichiers de données vers un tableur et effectuez une analyse standard en traçant les résultats sous forme de graphique. Les données d'exemple peuvent être analysées. Remises par seconde moyennées à partir de trois lectures par puits.

Des mouches sauvages Canton S et des mouches mutantes relish. E 20 dépourvues du gène NF kappa B ont été placées dans deux moniteurs d'activité en lumière constante et infectées par sia. Dans cet exemple, l'infection a favorisé le sommeil.

Il était clair que les mutants relish E 20 présentaient moins de sommeil que les mouches Canton s. témoins après infection. Conformément aux résultats précédents, les mutants relish E 20 succombaient également rapidement à l'infection par rapport aux mouches de type sauvage.

La majorité des mouches ont survécu à l'injection contrôle aseptique, indiquant que les mouches sont décédées à cause de l'infection et non de la blessure provoquée par l'injection. Étant donné que les mutants relish sont morts très rapidement, seules les mouches Canton s ont été utilisées pour démontrer la charge bactérienne après l'infection. Sia a continué à proliférer chez la mouche 24 heures après l'infection.

L'activité du rapporteur luciférase a montré une grande variation entre les mouches individuelles et entre la réussite des points de données. Bien que le signal provienne de tous les tissus de la mouche, on ne s'attend pas à ce que chaque tissu émette la même quantité de signal, et la visibilité du tissu par rapport au détecteur varierait au fur et à mesure que la mouche se déplace. Dans cet exemple, des mouches ont été infectées et comparées à un groupe témoin manipulé.

Les mouches décédées ont été exclues de l'analyse au sein d'un groupe de mouches. L'activité du rapporteur luciférase Kappa b augmente régulièrement après l'infection. L'activité du rapporteur luciférase Kappa b a également augmenté régulièrement après une blessure aseptique.

L'activité maximale se situait autour de 12 heures, tant après une lésion qu'après une infection. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment quantifier la fonction immunitaire et le sommeil chez les SSO après une infection. Nous pouvons mesurer le sommeil, la survie, le temps, l'élimination bactérienne et l'activité en temps réel d'un rapporteur de transcription non copié.