Les explants blastomères à l'essai pour l'engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

La méthode illustrée dans cette vidéo utilise des cartes de destin des embryons au stade de segmentation afin d'isoler des cultures de blastomères uniques pour évaluer si le destin embryonnaire est déterminé par des instructions intrinsèques ou extrinsèques. Tout d'abord, des embryons à deux cellules sont collectés, dans lesquels le premier sillon de division traverse la zone légèrement pigmentée de l'hémisphère animal. Ces embryons sont cultivés jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade de 16 à 32 cellules, puis la membrane vitelline est retirée et les cellules voisines sont disséquées autour de la cellule sélectionnée. Par exemple, le blastomère disséqué est ensuite transféré dans une dépression d'une cavité de culture recouverte d'agar et mis en culture.

Une fois que l'explante atteint le stade désiré, il est récolté afin d'évaluer l'expression des gènes ou des protéines par hybridation in situ, QPCR ou immunohistochimie. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes, telles que la culture de grands groupes de cellules embryonnaires ou d'organes en ligne, réside dans le fait que des blastomères embryonnaires individuels dont le destin développemental est connu grâce à des études de traçage lignagère peuvent être cultivés sans ajout de facteurs de croissance ni présence de cellules voisines. Ainsi, il est possible de tester directement si des facteurs intrinsèques à la cellule orientent ce blastomère vers un précurseur d'un tissu spécifique ou si cela nécessite des signaux provenant des cellules environnantes.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la dissection des Blairs et leur transfert dans les puits de culture exigent des manipulations délicates sous le microscope stéréo. Dans cette vidéo, j'utiliserai cette méthode pour déterminer si les ARNm d'origine maternelle orientent les cellules vers un destin neural. Travaillez sous un microscope de dissection. Aiguisez quatre paires de pinces à l'aide d'un film abrasif Illumina.

Une paire de forceps sert de secours au cas où une pointe serait endommagée pendant l'intervention ; stériliser à l'autoclave les quatre paires de forceps et les conserver dans un récipient stérile. Préparer 500 millilitres de solution saline de Barth modifiée (MBS) à 0,1 x et 500 millilitres à 1,0 x, puis filtrer pour stériliser. Conserver ces solutions de plusieurs mois à 14 à 18 degrés Celsius dans un flacon en verre à bouchon vissé. Préparer 2 % d'agarose de qualité électrophorèse dans 100 millilitres de milieu de culture à 1 x. Autoclaver pour dissoudre l'agarose et utiliser un four à micro-ondes pour liquéfier l'agarose lorsque cela est nécessaire ultérieurement, tant qu'elle est liquide.

Verser environ 0,5 millilitre au fond de chaque puits d'une plaque de culture stérile de 24 puits. Cela empêchera les implants de coller au plastique. Ensuite, verser environ deux à trois millilitres au fond de deux à trois boîtes de Pétri de 60 millimètres et agiter doucement pour répartir.

Ces derniers serviront de boîtes de dissection et l'agarose empêche les embryons de coller au plastique. Une fois leurs membranes retirées, lorsque l'agarose a refroidi et durci, passez la pointe d'une pipette Pasteur de six pouces à la flamme jusqu'à ce qu'elle fonde en une boule. Refroidissez brièvement la boule, puis touchez légèrement sa surface sur l'agarose dans une cavité de la plaque de culture.

Cela créera une dépression peu profonde dans laquelle l'explan X sera placé. Répéter pour chaque puits de la plaque. Ensuite, remplir chaque puits de la plaque de culture avec un millilitre d'un milieu de culture stérile x.

Ensuite, remplir la boîte de dissection avec du MBS 0,1 X pour faciliter la séparation des blastères. Une fois les boîtes de dissection préparées, transférer les œufs fécondés débarrassés de leurs gaines gélatineuses dans des boîtes de Pétri de 100 millimètres contenant un milieu de culture à 0,5 x. Ceux qui ne sont pas utilisés immédiatement peuvent être cultivés à 14 degrés Celsius pendant que la première boîte est examinée pour repérer les embryons à deux cellules.

Observer les embryons dans la première boîte de Pétri à l’aide d’un microscope stéréoscopique et, à l’aide d’une pipette plastique de transfert, transférer environ 10 embryons à une cellule et à deux cellules vers une boîte séparée contenant du milieu de culture à 0,5 x. Placer la boîte de Pétri dans un incubateur à 14 degrés Celsius. La capacité de ce test à évaluer précisément le potentiel de développement d’une cellule repose sur l’isolement précis de la blastomère adéquate selon les cartes de destin cellulaire.

Par conséquent, il est essentiel de choisir des embryons présentant le bon motif de pigmentation au stade deux cellules, ce qui correspond par la suite à des schémas de clivage réguliers. Comme illustré ici. Les clivages réguliers se produisent souvent uniquement sur un seul côté de l'embryon.

Ces embryons peuvent encore être utilisés comme donneurs si la cellule donneuse provient du côté normal. Lorsque les embryons atteignent le stade à deux cellules, trier ceux dont le premier sillon de clivage divise la zone légèrement pigmentée dans l'hémisphère animal et les placer dans un plat séparé ; trier environ cinq fois plus d'embryons que ceux qui seront disséqués. Ce seront les donneurs pour l'explant.

Conserver les deux embryons restants à deux cellules dans une boîte de culture séparée à côté des embryons donneurs tout au long de la procédure, afin de les utiliser comme témoins apparentés pour le stade de l'explant. Après le tri et la dissection des embryons, revenir aux boîtes de culture dans l'incubateur pour trouver d'autres embryons à une cellule et à deux cellules. Puisqu'il faut environ 90 minutes aux embryons à une cellule pour se diviser, cette étape peut être réalisée jusqu'à deux heures après la collecte des œufs.

Pour préparer l'explant, placez cinq à dix embryons dans une boîte de dissection. Ensuite, positionnez le premier embryon de manière à ce que la membrane vitelline transparente puisse être saisie avec une pince. Elle n'est généralement pas visible, mais peut être saisie au pôle animal, où elle est séparée par un espace périvitellin clair situé au-dessus de la surface de l'embryon.

À l’aide d’une pince aiguisée tenue dans une main, saisissez le blastocyste à une certaine distance du site d’incision afin d’éviter de l’endommager. Puis, avec une autre pince aiguisée tenue dans l’autre main, saisissez la membrane près de l’extrémité de la première pince et tirez doucement dans des directions opposées pour détacher la membrane. L’embryon s’aplatira une fois la membrane retirée.

Ensuite, saisissez une cellule voisine avec la pince et utilisez cette cellule comme poignée afin que la cellule à disséquer ne soit pas directement touchée par la pince dans l'autre main ; tirez délicatement les cellules voisines restantes loin de la cellule cible. Si les cellules médianes, qui partagent le même destin, sont ciblées, elles peuvent être retirées ensemble par paire. Enfin, disséquez la cellule servant de poignée.

Prenez la paire de blasème ou d'amère à l'aide d'une pipette Pasteur en verre stérile, en évitant les bulles d'air et une aspiration excessive. Placez l'extrémité de la pipette Pasteur sous la surface du milieu de culture dans une cavité de la boîte de culture X explant, puis expulsez délicatement le blasme. Celui-ci doit glisser dans la dépression peu profonde par gravité.

Des blasphemers provenant de plus d'un embryon peuvent être combinés en un seul explan en les déposant dans la même dépression d'une culture. Nous répéterons cette procédure avec les embryons restants dans la boîte de dissection un par un. Après environ 10 embryons, la boîte de dissection sera remplie de débris cellulaires.

Lorsque cela se produit, passez au plat de dissection suivant. Une fois toutes les dissections terminées, vérifiez si les explants se trouvent dans les dépressions peu profondes. Sinon, ils peuvent être doucement poussés dans la dépression à l’aide d’une boucle de cheveu stérilisée dans de l’éthanol à 70 % et séchée à l’air. Incubez les implants à température ambiante sur la paillasse environ une heure après la dernière dissection.

Retirez les débris entourant l'explante cicatrisé à l'aide d'une pipette Pasteur en verre stérile. Placez la plaque d'explante à 14 à 20 degrés Celsius à côté de la boîte de Pétri contenant les embryons témoins provenant de la même portée. Les embryons frères indiqueront le stade de développement de l'explante blasphème.

Après environ une à deux heures en culture, les blastomères explantés se seront divisés environ quatre fois et auront rejeté la majeure partie des débris provenant des cellules voisines endommagées. Après 20 heures, ils forment de petites sphères compactes de cellules. Lorsque les cellules sœurs atteignent le stade de développement souhaité, récoltez l'explant.

Ces explants survivent assez bien, même si certaines cellules se désintègrent. Par conséquent, s’il y a une masse trouble dans la culture, nous l’explorons à l’aide d’une anse en cheveu ou de pinces pour déterminer si un explant sain est enfoui à l’intérieur. Prélevez l’explant dans un petit volume de solution de culture à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et expulsez-le délicatement dans un fixateur ou un tampon de lyse adapté au test à réaliser.

Deux blastomères dorsaux ou deux blastomères ventraux ont été disséqués au stade 16 cellules et cultivés dans un XMBS à 14 degrés Celsius jusqu'à ce que les embryons fraternels atteignent les stades précoces de plaque neurale. Chaque échantillon a été analysé pour l'expression d'une plaque neurale zygotique. Le gène Sox deux a été détecté par hybridation in situ, qui apparaît comme un produit de réaction bleu.

Les résultats de ce test montrent que la majorité des blastomères animaux dorsaux, qui sont des précurseurs de la plaque neurale, peuvent exprimer de manière autonome SOX2, c'est-à-dire sans signalisation supplémentaire provenant d'autres régions de l'embryon. Les échantillons qui n'expriment pas SOX2 pourraient avoir été incorrectement identifiés au moment de la dissection.

En revanche, aucun des blastomères animaux ventraux, qui sont des précurseurs de l'épiderme ventral, n'exprime SOX2. Ces données indiquent que les blastomères animaux dorsaux possèdent une capacité intrinsèque à former un tissu nerveux, alors que les blastomères animaux ventraux ne la possèdent pas. Certains des explants dorsaux présentent également une morphologie allongée, indicative d'une formation du mésoderme dorsal.

Ces blastomères participent également à la formation du Noor dans l'embryon intact et une culture d'explant exprime une protéine marqueur du Noor afin de tester l'effet de la modification des niveaux endogènes d'un gène neural d'origine maternelle. Des ARNm Fox D cinq ont été injectés dans les blastomères précurseurs ventraux à huit cellules. Comme illustré ici, la majorité des implants ventraux exprimaient SOX deux.

En revanche, lorsque le niveau endogène de Fox D cinq a été réduit par injection d'oligonucléotides morpholinos antisens dans les précurseurs dorsaux des huit cellules, seul un petit nombre d'explants dorsaux a exprimé SOX deux. Ces expériences indiquent que l'expression maternelle de Fox D cinq joue un rôle dans la capacité intrinsèque des blastomères dorsaux à acquérir un destin neural avant cette procédure. D'autres méthodes, telles que l'injection dans les blastomères à disséquer d'ARNm pour un gain de fonction ou d'oligonucléotides morpholinos antisens pour une perte de fonction, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires.

Par exemple, quels gènes sont impliqués dans la capacité intrinsèque des cellules à donner une destinée développementale spécifique ? En outre, on peut tester des facteurs de signalisation connus en ajoutant des facteurs purifiés au milieu de culture. Cette approche peut également être utilisée pour transplanter des blastomères individuels vers de nouveaux emplacements dans l'embryon intact.

Ce test détermine si la cellule transplantée est engagée dans son destin développemental d'origine ; cette information est essentielle pour définir les mécanismes cellulaires par lesquels une cellule embryonnaire pluripotente s'engage à devenir le précurseur d'un tissu défini.