Suivi cellule à l'aide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre

L'objectif général de cette procédure est de suivre des cellules photo-commutées dans un embryon vivant de poisson zèbre. Cela est réalisé en incorporant d'abord un embryon exprimant une protéine fluorescente photoconvertible spécifique à un tissu dans de l'agarose à bas point de fusion. Ensuite, la protéine dans la région d'intérêt est entièrement photoconvertie.

Ensuite, l'embryon est soigneusement retiré de l'agarose et maintenu dans de l'eau d'œufs à 28,5 degrés Celsius jusqu'aux stades ultérieurs. Enfin, l'embryon photoconverti est à nouveau inclus dans de l'agarose à bas point de fusion. En définitive, les résultats obtenus permettent de montrer que les cellules photoconverties peuvent être détectées avec précision aux stades ultérieurs grâce à la présence stable de la protéine photoconvertie, par microscopie confocale.

Nous pensons donc que la méthode que nous présenterons aujourd'hui sera très utile dans le contexte de la biologie cellulaire et du développement. Nous estimons que l'utilisation de cette méthodologie dans l'étude de la migration cellulaire, de la dynamique tissulaire et d'autres comportements cellulaires s'avérera particulièrement intéressante. La procédure sera démontrée par Veronica Lombardo, une postdoctorante de mon laboratoire, après avoir croisé des poissons-zèbres transgéniques exprimant une protéine fluorescente photoconvertible.

Choisissez les embryons les plus fluorescents qui sont homozygotes et faites-les croître à 28,5 degrés Celsius lorsqu'ils ont atteint le stade souhaité. Utilisez une pince pour les désenkyster dans un récipient en verre contenant de l'eau pour œufs afin d'anesthésier les embryons. Utilisez une pipette en verre ou une pipette à embout coupé pour les transférer un par un dans le trica.

Transférez un embryon anesthésié sur le couvercle d'une boîte de culture et maintenez l'embryon dans le plus petit volume possible de milieu. Transférez l'embryon dans de l'agros en le pipetant avec de l'agros à 1 % à basse température de fusion contenant du trica à 30 degrés Celsius, puis placez-le dans une boîte de culture dont le fond est constitué d'un couvre-objet. Utilisez une pointe en plastique lisse pour orienter l'embryon une fois que l'agros a polymérisé.

Le recouvrir de la solution Trica sur un microscope confocal inversé équipé de sources laser de 405, 488 et 561 nanomètres et d'un objectif 20 x. Utiliser les lasers de 488 et 561 nanomètres pour générer un empilement en Z de l'ensemble de la structure de l'échantillon, y compris la région d'intérêt. Sélectionner l'outil de série temporelle et le régler sur deux cycles sans intervalle, un avant et un après la photoconversion.

Sélectionnez l'outil de région et définissez une ou plusieurs régions d'intérêt pour la conversion photochimique. Ensuite, sélectionnez l'outil de blanchiment et configurez-le pour commencer le blanchiment après l'analyse. L'un des deux utilisés ici est un laser à diode de 30 milliwatts à 405 nanomètres.

Optimisé avec soin pour utiliser la quantité minimale de lumière laser nécessaire à la photoconversion complète, obtenue en faisant varier l'intensité de la lumière laser, le nombre de balayages de la région d'intérêt et la vitesse de balayage. Balayer l'échantillon avec les lasers de 488 nanomètres et de 561 nanomètres pour visualiser toute fluorescence verte résiduelle ainsi que la fluorescence rouge photoconvertie de la protéine fluorescente photoconvertible. Après la photoconversion, éliminer la solution et, à l'aide d'une aiguille ou d'une pointe en plastique lisse, retirer délicatement l'embryon de l'agros.

Conserver l'embryon dans l'eau d'œuf à l'obscurité à 28,5 degrés Celsius jusqu'au stade de développement souhaité. Enrober une deuxième fois l'embryon, puis générer un Zack de l'échantillon, incluant la région d'intérêt, en utilisant à nouveau les lasers de 488 et 561 nanomètres. Étant donné que ce protocole n'affecte pas le développement normal, il est possible d'observer l'embryon photoconverti à des stades ultérieurs.

Voici un exemple de dosage de conversion photochimique. Des cellules endothéliales ont été suivies au cours du développement du poisson zèbre, de 48 à 72 heures après la fécondation, à l’aide d’une lignée transgénique rapporteuse exprimant kick G dans les noyaux endothéliaux, comme illustré ici. Avant la conversion photochimique, kick G était exprimé au sein du tissu endothélial et n’était détectable que sous forme de fluorescence verte à l’aide de balayages contrôles au laser argon de 488 nanomètres. Aucune détection de kick GR photoconverti n’a été observée avec un laser de 561 nanomètres pour la fluorescence rouge avant la conversion photochimique.

Par la suite, la région d’intérêt a été entièrement photoconvertie à l’aide d’un laser à diode de 405 nanomètres, à une intensité de 10 % et sur 20 itérations, puis les vaisseaux crâniens ont été de nouveau scannés à l’aide des lasers de 488 nanomètres et 561 nanomètres. Dans ce panneau, la fluorescence verte de la protéine Kick G s’est complètement transformée en rouge dans la région d’intérêt, permettant de suivre les cellules endothéliales photoconverties aux stades ultérieurs. L’embryon a été observé 24 heures après la photoconversion, soit environ 72 heures après la fécondation, au niveau des tissus endothéliaux issus de la région d’intérêt photoconvertie.

Des protéines G kick tant non converties que photoconverties ont été observées en raison de la stabilité de la forme photoconvertie rouge fluorescente de kick g, et de la synthèse de nouvelles protéines G kick vertes non converties après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biologie du développement pour explorer la biologie cellulaire et le remodelage des tissus chez plusieurs espèces de poissons.