La méthode MODS pour le diagnostic de la tuberculose et la tuberculose multirésistante

Pour chaque groupe de trois personnes dans le monde, l'une est infectée par la tuberculose. Le diagnostic de la tuberculose active permet de prévenir de nouvelles infections, car les patients atteints de tuberculose active contaminent entre 10 et 15 autres personnes par an, jusqu'au moment où ils sont traités ou décèdent. MODS est un acronyme que nous utilisons afin d'éviter de devoir dire « observation microscopique, test de sensibilité aux médicaments », et la raison pour laquelle il porte ce nom deviendra évidente au fur et à mesure que la méthodologie sera expliquée.

Dans la courte vidéo, nous présenterons la méthodologie MODS pour le diagnostic rapide et peu coûteux de la tuberculose et de la tuberculose multirésistante. La vidéo exposera étape par étape la méthodologie. Nous aborderons les implications en matière de biosécurité liées au travail avec des cultures liquides, et nous expliquerons également certains aspects importants de l'assurance qualité nécessaires à l'utilisation de cette méthodologie.

Le test mods a été mis au point à l'Université Kayana à Lima, au Pérou, dans le laboratoire de Bob Gilman. Suite à des observations initialement faites par loose cavi. LOOSE tentait d'identifier des méthodes rapides pour détecter le mycobactérium tuberculosis dans des cultures en utilisant des indicateurs colorimétriques.

Mais elle a noté que l'observation de ces cultures au microscope révélait la présence d'une croissance de microbactéries plusieurs jours avant que les indicateurs colorimétriques ne changent de couleur, et c'est à partir de cette observation que le test MOD a été mis au point. Le test MOD a été développé dans un contexte à ressources limitées et vise spécifiquement les contextes à ressources limitées, avec un coût légèrement inférieur à 3 € par test pour la détection de la tuberculose et de la résistance multithérapeutique par culture liquide. Il est extrêmement attractif et, pour la première fois, rend ce type de capacité diagnostique accessible dans les lieux où les ressources sont limitées.

Ainsi, le test MODS repose sur trois principes fondamentaux. Le premier est que Mycobacterium tuberculosis se développe en milieu liquide beaucoup plus rapidement qu'en milieu solide. Ce fait est connu depuis de nombreuses années.

Deuxièmement, si nous observons ces milieux liquides au microscope, nous pouvons détecter la croissance de Mycobacterium tuberculosis beaucoup plus rapidement qu’en attendant l’apparition macroscopique de colonies sur milieux solides. En effet, cette croissance présente des caractéristiques tout à fait distinctives, nous permettant de différencier M. tuberculosis dans les milieux liquides des contaminations bactériennes ou fongiques, ou encore de la croissance de mycobactéries atypiques non tuberculeuses qui pourraient être présentes. Enfin, et c’est peut-être l’aspect le plus intéressant du test MODS, nous pouvons incorporer des médicaments tels que la rifampicine, et ainsi détecter directement à partir du crachat la résistance multithérapeutique.

En utilisant ces médicaments dès le début du test, nous pouvons détecter la tuberculose et, en même temps, déterminer si l'isolat est résistant ou non à ces deux médicaments. Cela élimine ainsi la nécessité de réaliser une sous-culture et un test indirect de sensibilité aux médicaments. Nous allons maintenant présenter les équipements nécessaires pour effectuer le test MODS.

Un réfrigérateur est nécessaire pour stocker les milieux préparés. Une balance est requise pour peser l'IS et la rifampicine. Un vortex est nécessaire pour mélanger l'expectoration.

Avec la solution de décontamination, une centrifugation est nécessaire pour concentrer l'échantillon de crachats décontaminé, et celle-ci doit être capable d'atteindre 3000 G. La centrifugeuse n'a pas besoin d'être réfrigérée, mais il est absolument essentiel qu'elle soit conforme aux normes de sécurité biologique. Pour les travaux sur les mycobactéries, les godets de la centrifugeuse doivent pouvoir être scellés avec des couvercles verrouillables. Un incubateur capable d'atteindre 37 et de maintenir 37 degrés Celsius est requis.

Cela n'a pas besoin d'être enrichi en CO2. Un microscope inversé est nécessaire pour lire les plaques MODS, équipé d'objectifs 4x et 10x. Un autoclave est nécessaire pour stériliser les milieux et pour l'élimination des cultures de micro-organismes. Des micropipettes sont requises pour les prélèvements d'aliquote dans les milieux. Une cabine de sécurité biologique de classe II est indispensable pour les procédures impliquant la manipulation d'échantillons de crachats et l'inoculation des plaques.

Les réactifs nécessaires pour réaliser le test mods sont les suivants : le milieu Middlebrook 7H9, le caséine et le glycérol Panta, qui est le supplément antibiotique, ainsi que l'OADC. Les stocks de suppléments nutritionnels comprennent les antibiotiques is et la rifampicine, le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour la préparation de la rifampicine, l'hydroxyde de sodium, le citrate de sodium et la L-cystéine pour la décontamination des crachats, le dihydrogénophosphate de sodium et le monohydrogénophosphate de potassium pour la préparation du tampon phosphate, l'hypochlorite de sodium à 10 % pour l'élimination des déchets infectés, ainsi qu'un désinfectant pour le nettoyage des surfaces de travail. Les plastiques et consommables suivants sont également requis : des tubes en verre stériles, des filtres de 0,2 micromètre pour solvants aqueux et des filtres de 0,2 micromètre pour solvants organiques, des tubes de microcentrifugeuse, des tubes de centrifugeuse de 15 ml, des tubes stériles de 50 ml et de 10 ml, des pipettes serologiques, des pastilles de pipettes stériles, des pointes de micropipettes stériles, des plaques de culture tissulaire de type 24 puits, et des sacs hermétiques de type Ziploc dans lesquels les plaques de 24 puits sont placées après l'inoculation de l'échantillon de crachat dans le milieu.

Il existe quatre groupes de solutions mères qui peuvent être préparés à l'avance. La solution tampon phosphate est composée d'un mélange de solutions de phosphate de sodium, de diba et de phosphate de potassium monobasique, ajustée à un pH de 6,8 ± 0,2. Cette solution est stérilisée par autoclavage à 121 à 124 degrés Celsius pendant 15 minutes, et un aliquot est cultivé sur gélose nutritive afin de confirmer la stérilité.

Ceci peut être conservé au réfrigérateur à une température de deux à huit degrés Celsius pendant un mois au maximum. Chaque échantillon de crachats nécessite 10 millilitres de solution tampon phosphate. La solution mère pour la décontamination des crachats est une combinaison d'hydroxyde de sodium et de citrate de sodium.

Ces solutions sont mélangées en volumes égaux et stérilisées à l'autoclave à 121 à 124 degrés Celsius pendant 15 minutes ; elles peuvent également être conservées au réfrigérateur à 2 à 8 degrés Celsius pendant un mois au maximum. Deux millilitres de cette solution sont nécessaires pour chaque échantillon de crachats. Le milieu de culture de base est composé de Middlebrook 7H9 avec casitone et glycérol.

La poudre sept H neuf est dissoute dans de l'eau distillée stérile contenant du glycérol et de la caséine, puis mélangée avec agitation constante jusqu'à dissolution complète. Ce milieu est stérilisé à l'autoclave à 121 à 124 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis, après refroidissement, réparti en aliquotes de 4,5 millilitres dans des tubes en verre stériles de 16 par 100 millimètres. Le milieu est incubé à 37 degrés pendant 48 heures afin de vérifier la stérilité, indiquée par l'absence de turbidité à l'issue de cette période, et peut être conservé de 2 à 8 degrés Celsius, avec le bouchon bien fermé, jusqu'à un mois.

Chaque échantillon de crachats nécessite un tube contenant 4,5 millilitres de ce milieu de culture. Les solutions mères d'antibiotiques sont préparées comme suit : elles sont complètement dissoutes dans de l'eau distillée stérile et filtrées à l'aide d'un filtre à seringue de 0,2 micromètre pour les solvants aqueux. Des aliquotes de 20 microlitres peuvent ensuite être conservées dans des tubes microcentrifuge stériles à moins 20 degrés Celsius pendant jusqu'à six mois ; chaque aliquote de 20 microlitres est suffisante pour jusqu'à cent échantillons.

Des solutions mères de rifampicine à huit milligrammes par millilitre sont préparées en dissolvant la rifampicine dans du DMSO et de l’eau distillée stérile. Ce mélange est filtré à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 micromètre pour solvants organiques, et la solution peut être conservée en aliquots de 20 microlitres dans des tubes microcentrifuge stériles à moins 20 degrés Celsius pendant jusqu’à six mois. Chaque aliquot de 20 microlitres est suffisant pour jusqu’à 100 échantillons. Nous abordons maintenant la partie proprement dite de la méthodologie et les trois étapes à suivre le jour de la procédure.

Ceci consiste à convertir les solutions mères en solutions de travail. Tout d'abord, nous avons la solution de décontamination, puis la solution de milieu. Et enfin, les solutions de travail des médicaments isen et Rifampicine.

La méthode de décontamination, utilisée pour la méthodologie mods, est la méthodologie normalisée de décontamination au nalk, l'hydroxyde de sodium. Le nalk est un mucolytique, qui aide à digérer l'expectoration et permet à l'hydroxyde de sodium d'assurer la décontamination. Pour cela, nous avons besoin de notre solution mère d'hydroxyde de sodium et de citrate de sodium, à laquelle on ajoute 0,1 gramme de NA dans 20 ml de cette solution.

Toute solution non utilisée le jour de sa préparation doit être jetée. La préparation finale du milieu de culture doit également être effectuée uniquement le jour de son utilisation. Le milieu 7H9 stocké est combiné avec OADC et Panta ; 4,5 millilitres du milieu sont mélangés avec 0,5 millilitre d’OADC et 0,1 millilitre de Panta dans chaque tube.

Cela suffit pour un échantillon. Les solutions travail de chaque médicament sont préparées le jour de l'utilisation, et toutes les solutions non utilisées doivent être jetées car l'activité ne peut être garantie. Les aliquotes sont diluées de manière sérielle dans des plaques de culture tissulaire 24 puits avec le milieu seven H nine oh A DC, de sorte que la concentration finale dans le puits, obtenue après l'ajout de l'échantillon de crachats avec le milieu, soit de 0,4 microgramme par millilitre pour l'acide forique et de 1 microgramme par millilitre pour la rifampicine.

Passons maintenant à la procédure de décontamination : deux millilitres d'échantillon de crachats sont placés dans un tube conique Falcon et deux millilitres de notre solution de décontamination au lait d'hydroxyde de sodium sont ensuite ajoutés. Le couvercle est remis en place et vissé hermétiquement, puis la suspension est homogénéisée par vortex et laissée reposer pendant 15 minutes, période durant laquelle se déroule la décontamination. Après ce temps, 14 millilitres de solution tampon phosphate sont ajoutés.

Le couvercle est remis en place et vissé fermement, puis le tube est placé dans la centrifugeuse après 50 minutes à 3000 G ; le surnageant S est décanté et le culot restant constitue l'échantillon que nous souhaitons étaler à l'aide des tubes de 5,1 millilitres de sept H nine OEDC panter. Notre culot est mis en suspension dans un volume d'environ deux millilitres. La moitié de cet échantillon resuspendu est conservée comme sauvegarde dans un tube de microcentrifugeuse.

Il est alors disponible au cas où notre culture deviendrait contaminée et que nous devions replater l'échantillon. Le millilitre restant est ajouté aux sept millilitres restants de H nine oh a DC panter contenus dans notre tube en verre, et constitue notre échantillon prêt à être plater. 900 microlitres de cette suspension de milieu et d'échantillon sont placés dans chacun des quatre puits d'une colonne d'une plaque de 24 puits.

Les puits restants de la plaque 24 puits sont remplis avec des échantillons successifs de sorte que cinq échantillons occupent une plaque 24 puits, un par chacune des cinq colonnes, et la sixième colonne est laissée sans échantillon. La sixième colonne sert de contrôle négatif dans cette colonne. Elle contient tous les constituants du milieu sans échantillon de crachats, et toute croissance observée dans cette colonne indique clairement un problème de contamination croisée, auquel cas toute la plaque doit être jetée.

Chaque plaque que nous utilisons nécessite une colonne de contrôle négatif. Nous disposons maintenant de notre plaque contenant tous nos échantillons et le milieu. Nous devons ajouter nos suspensions d'antibiotiques dans une plaque distincte.

Nous avons préparé nos dilutions de rifampicine et d'isid comme décrit précédemment, et à l’aide d’une pipette multipuits à quatre canaux, nous prélevons 100 microlitres dans chacun de ces puits et ajoutons 100 microlitres de sept H neuf OADC dans chacun des deux puits témoins, ainsi que 100 microlitres de rifampicine et 100 microlitres d'isid dans chacun des deux puits contenant le médicament. Une fois la plaque terminée, le couvercle est remis en place et celle-ci est placée à l’intérieur d’un sac Ziploc. À partir de ce moment, le sac n’est plus ouvert, de sorte que les cultures qui se développent en milieu liquide n’ont jamais l’occasion d’être exposées à l’extérieur du sac.

Toutes les lectures de la plaque à partir de maintenant sont effectuées à l’intérieur du sac, et le sac est placé dans un sac pour autoclave puis éliminé à la fin de la culture. De cette manière, nous évitons la manipulation de suspensions fortement concentrées de mycobactéries. Nous allons maintenant dire quelques mots sur le contrôle qualité.

La méthodologie MODS intègre des contrôles de qualité intégrés, essentiels pour une utilisation correcte du test. Tout d'abord, des contrôles négatifs sont réalisés sur chaque plaque. Ces contrôles ont déjà été mentionnés précédemment, mais pour résumer, une colonne contient tous les constituants du milieu sans échantillon de crachats, aux côtés de cinq autres échantillons de crachats sur la plaque. Les puits de cette colonne doivent être examinés comme tous les autres puits, et la présence d'une quelconque croissance dans ces puits indique une contamination croisée, rendant alors tous les résultats de la plaque non fiables.

La plaque doit donc être jetée et tous les échantillons doivent être replaqués. En outre, il existe des contrôles internes qui servent de contrôles positifs. Ces contrôles sont analysés sur une plaque distincte, préparée après que toutes les autres plaques d'échantillons ont été préparées, à la fin de la journée, afin de minimiser le risque de contamination croisée au sein du laboratoire.

Sur cette plaque distincte, on utilise une souche totalement sensible de mycobactérie tuberculeuse et une souche résistante à l'isid et à la rifampicine. Si l'on craint de manipuler une souche multirésistante sur une plaque, une souche résistante uniquement à la rifampicine peut être utilisée à la place de ces deux souches sensible et multirésistante. L'objectif de ces souches est de démontrer non seulement que le milieu permet la croissance – ainsi, tous nos contrôles positifs doivent présenter une croissance dans le puits sans antibiotique –, mais aussi que les concentrations en antibiotiques sont correctes ; par conséquent, les contrôles positifs sensibles ne doivent pas croître en présence d'is et de rifampicine, tandis que les contrôles positifs résistants doivent évidemment croître malgré les concentrations de rifampicine et d'is présentes dans la plaque.

Très bien, passons maintenant à la lecture des plaques. Si l'on considère le jour de la mise en culture de nos échantillons comme le jour zéro, la lecture des plaques commence au jour cinq. Avant cette date, la croissance mycobactérienne est très rarement observée.

Les plaques sont examinées au microscope optique inversé. Autrement dit, les plaques sont observées de bas en haut, ce qui permet de visualiser très clairement les cordons, alors que l'observation des cultures depuis le haut est gênée par la condensation sur le couvercle des plaques, ainsi que par une distance focale inadaptée sur un microscope standard. L'examen microscopique est généralement réalisé avec un objectif 10 x, une culture étant considérée comme positive lorsqu'elle présente au moins deux unités formant des colonies dans chacun des puits sans médicament.

La présence de contamination est facilement reconnaissable car le milieu devient trouble et, au cinquième jour, il y a généralement une surcroissance dans la majeure partie du puits. En revanche, la croissance mycobactérienne ne provoque pas de trouble du puits ; la croissance initiale des mycobactéries forme de petites structures en forme de virgule, qui progressent régulièrement pour former des cordons ou des enchevêtrements caractéristiques. En deux semaines, une croissance fortement positive aura formé des conglomérats de mycobactéries, les cordons n'étant clairement visibles qu'aux extrémités.

La grande majorité des cultures qui deviendront positives le sont d'ici le jour 14 ; nous recommandons donc des lectures quotidiennes du jour 5 au jour 14, puis des lectures tous les deux ou trois jours selon la charge de travail du laboratoire. Le jour où une culture est clairement positive dans les deux puits sans médicament, les puits contenant le médicament doivent être lus. Toute croissance en présence de l'un des médicaments indique une résistance à ce médicament. Il est très important de noter que si la lecture des puits contenant le médicament est effectuée plus d'une semaine après la détection d'une culture positive dans les puits sans médicament, cela pourrait ne pas représenter une résistance, car une croissance de percée occasionnelle peut être observée.

Les lectures peuvent être arrêtées au jour 21 si une culture est négative, car aucune culture positive n'est observée après cette période chez les patients ne recevant pas de traitement. Une fois les 21 jours d'incubation terminés, les cultures peuvent être éliminées. Les cultures restent à l'intérieur de leurs sacs Ziploc et sont placées dans des sacs pour autoclave, puis stérilisées à 121 à 124 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes, après quoi elles peuvent être éliminées en toute sécurité. Je vais simplement dire quelques mots maintenant sur la biosécurité et le test MODS, car nous avons déployé ce test non seulement au Pérou, mais aussi dans des contextes en Afrique et en Asie.

Une question récurrente concerne la sécurité et la biosécurité liées à l'utilisation de cultures microbactériennes en milieu liquide. Cette crainte est compréhensible, car il est évident que les liquides peuvent être renversés, contrairement aux milieux solides qui n'entraînent pas ce risque, et parce qu'il existe également un risque d'aérosolisation lorsqu'on manipule des suspensions de mycobactéries. C'est précisément pour ces raisons que nous considérons que la méthode mod est une approche plus sûre que toute autre méthode nécessitant un test indirect de sensibilité aux antibiotiques.

La raison en est que, pour le test de sensibilité indirect, une suspension de microbactéries à concentration connue est préparée. Cela implique donc la manipulation de solutions fortement concentrées de microbactéries, avec tous les risques associés de déversement et d'aérosolisation. En revanche, la méthode MODS, comme vous l'avez maintenant vu, consiste simplement à ensemencer un échantillon d'expectoration dans notre boîte de culture, après quoi la boîte est scellée dans un sac en plastique.

Ce sac n'est jamais rouvert, et nous n'avons donc pas à manipuler ces suspensions fortement concentrées. Cela ne signifie pas que nous considérons la méthode mod comme totalement sans danger : la manipulation des mycobactéries comporte toujours un risque. Toutefois, des données provenant de Corée publiées en 2006 semblent avoir confirmé notre position selon laquelle les mods ne présentent pas un danger supérieur à celui de l'ensemencement de toute autre culture.

Cette étude, menée auprès de techniciens de laboratoire, a montré que les risques professionnels auxquels sont exposés les techniciens qui ensemencent des cultures et n'ont aucune responsabilité dans les tests de sensibilité aux médicaments ne sont pas plus élevés que ceux des personnes effectuant la microscopie directe de crachats. En revanche, les personnes manipulant des suspensions de mycobactéries et réalisant des tests de sensibilité aux médicaments présentent des taux nettement plus élevés de risque professionnel de tuberculose. Il est donc primordial que tous les membres du personnel de laboratoire soient protégés au maximum, et nous recommandons donc vivement que ces procédures ne soient effectuées qu'avec une protection respiratoire individuelle adéquate, c'est-à-dire des masques conformes à la norme N95.

En outre, une hotte de sécurité biologique de classe deux est nécessaire, dans laquelle toutes les zones d'évacuation sont filtrées par des filtres HEPA. Enfin, un mécanisme simple mais très important pour éviter les turbulences de l'écoulement d'air dans un laboratoire est un verrouillage de la porte du laboratoire, empêchant l'entrée et la sortie de personnel pendant le traitement des échantillons. Cela réduit le risque de transmission à l'intérieur du laboratoire. J'espère donc que cela vous a donné un bon aperçu de ce qu'implique la méthodologie MODS, ainsi que de son utilité potentielle dans les contextes où les ressources sont limitées, mais où des diagnostics de qualité élevée pour la tuberculose et la tuberculose multirésistante sont urgemment nécessaires.

Pour plus d'informations, vous pouvez visiter notre site web, mods peru. org, où vous trouverez nos procédures opératoires normalisées détaillées, ainsi que le guide utilisateur de mods. En complément des POP relatives au traitement des échantillons extrapulmonaires, nous mettons également à disposition une bibliothèque photographique de mycobactéries et de tuberculose, d'autres mycobactéries, ainsi que de contaminations bactériennes et fongiques. Vous y trouverez également notre stratégie d'assurance qualité et la procédure que nous recommandons pour l'accréditation des laboratoires souhaitant commencer à utiliser mods.

Enfin, une fiche de questions fréquemment posées est disponible, et nous accueillons volontiers les retours des utilisateurs qui emploient actuellement des mods, car il s'agit d'une méthodologie itérative. Comme nous l'avons expliqué précédemment, il s'agit d'un test non propriétaire et nous sommes toujours intéressés par les améliorations que d'autres laboratoires ont pu apporter.