הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מהיר של הרכיבים העיקריים של תערובת הליפידים של שמרים. התהליך מתחיל באיסוף ושטיפה של תאי שמרים. התאים השטופים מוכנסים לתערובת של כלורופורם ומתנול ביחס של אחת לשתיים, ומולייזים באמצעות גלגלי זכוכית.

הוספה של כלורופורם ומים מפרידה בין שני השלבים. השלב האורגני נאסף ומיובש, ולאחר מכן שכבת הליפידים מומסת בכלורופורם לצורך אחסון לפני ספקטרוסקופיית מסות. הליפידים שהופקו מדוללים בכלורופורם ומתנול עם אמוןיום הידרוקסיד, ותערובת של סטנדרטים פנימיים מתווספת למסה.

עתה ניתן להזריק את תמיסת הליפידים ישירות למספקטרומטר המסה. שלום, אני סיימון בורק מהמעבדה של ולדימיר טקו במחלקה לביולוגיה של אוניברסיטת קונקורדיה. היום אראה לכם שיטה לכימות ליפידים של שמרים באמצעות ספקטרוסקופיה של מסה.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור שינויים בליפידים של שמרים תחת תנאי גידול שונים. בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, יש להשעות מחדש את כדורי השמרים הקפואים שהוכנו מראש ב-1.6 milliliters של מים מזוקקים קרים (בטמפרטורת קרח), ולהעביר 1.6 milliliters של תרחיף התאים למבחנות צנטריפוגה מזכוכית המיועדות למהירות גבוהה.

שימו לב כי לאורך פרוצדורה זו, כל המניפולציות עם הליפידים שהופקו מבוצעות באמצעות פיפטות זכוכית או מזרקים. מכיוון שפלסטיקה תיצור אות רקע חזק, במידה ותבוא במגע עם כלורפורם, התחילו את הפקת הליפידים על ידי הוספה של שש מיליליטרים של תערובת כלורפורם-מתנול ביחס של 1:2 ו-0.8 מיליליטרים של כדוריות זכוכית שנמדדו בתוך צינור אינור (einor tube) לסuspended התאים. הנפחים המדויקים אינם קריטיים כל עוד נשמר היחס של 1:2:0.8 עבור כלורפורם, מתנול ושמרים תלוים במים. בצעו ערבוב ב-Vortex.

ערבב את תרחיף התאים ואת כדוריות הזכוכית פעמיים, למשך דקה בכל פעם, והמשך בהוספה של 2 mL כלורופורם וערבוב עדין, ולאחר מכן הדגר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם. לאחר ד incubating של חמש דקות, הוסף 2 mL מים מזוקקים וערבב בעדינות. לאחר מכן, הדגר שוב למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם.

גם כאן, חשוב יותר לשמור על יחס של 2:2:1.8 עבור כלורופורם, מתנול ומים מאשר על נפח ספציפי. עם השלמת הדגירה השנייה, סבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3000 Gs בטמפרטורת החדר, אספו את כל העלייה (supernatant) מההפקה הראשונה הזו למבחנת צנטריפוגה מזכוכית חדשה המיועדת למהירות גבוהה, והוסיפו 3.2 milliliters של כלורופורם למשקעי התאים שנותרו עבור הפקת ליפידים שנייה.

ערבבו במערבל וורטקס את משקעי התאים עם הכלורופורם שהוסף פעמיים, למשך דקה אחת בכל פעם. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3000 Gs. בטמפרטורת החדר, הוסיפו את העלייה (supernatant) מההפקה שנייה זו לעלייה שנאספה לאחר ההפקה הראשונה. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה את העליות שנאספו למשך חמש דקות.

ב-3000 Gs בטמפרטורת החדר, הליפידים שהופקו מומסים כעת בפזה האורגנית התחתונה. השליכו את הפזה המימית העליונה והעבירו את הפזה התחתונה למבחנת צנטריפוגה מזכוכית חדשה המיועדת למהירות גבוהה. כדי להפיק ספקטרום נקי יותר בספקטרומטר המסה, סובבו את הפזה האורגנית בצנטריפוגה במשך חמש דקות ב-3000 Gs בטמפרטורת החדר והעבירו את כל העילאי למבחנה מזכוכית.

ייבשו את הליפידים המומסים תחת חנקן, המיסו את שכבת הליפידים המיובשת ב-500 microliters של כלורופורם ואחסנו בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius עד למועד ניתוח הדגימות באמצעות ספקטרומטריית מסות. התחילו בהכנת תערובת סטנדרט של הליפידים בכלורופורם כפי שמופיע בטבלה 1 בפרוטוקול הכתוב המצורף. כל ליפיד מייצג מחלקה שונה.

ניתן לשמור תמיסה זו במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר, לפני הזרקת הליפידים המופקים למספקטורומטר מסות. ערבבו 10 µL מהדגימה עם 10 µL מתערובת הליפידים הסטנדרטית. שימו לב שניתן לשנות את יחס הסטנדרט לדגימה לפי הצורך.

בצע הפרדה של תערובת הליפידים של הדגימה והסטנדרט באמצעות ספקטרומטר מסות Q to F micro mass, המצויד במקור nano electrospray הפועל בקצב זרימה של 1 µL לדקה. ההגדרות מפורטות בטבלה 2 של הפרוטוקול הכתוב המצורף. למרות שהשימוש ברזולוציה הגבוהה של ספקטרומטר מסות Q to F הוא יתרון, אין מדובר בדרישה חובה.

פרמטרי המכשיר המדויקים ישתנו בין ספקטרומטרי מסות שונים. לאחר רכישת הנתונים, ספקטרי המסות עוברים החלקה, הפחתת רקע ומירכוז של הפיקים. לבסוף, ייצא את רשימת הפיקים ל-excel.

לאחר מכן, בצעו נורמליזציה של הפסגות של כל דגימת ליפיד ביחס לסטנדרט הפנימי שלהן. בהתאם ליישום, ייתכן שיהיה צורך בביצוע עיבוד נוסף, כגון הסרת איזוטופים (de-isotope) ודה-קונבולוציה (deconvolution). שיטה זו מאפשרת קביעה מעמיקה ומהירה של הרכיבים העיקריים של פרופיל הליפידים של השמרים.

כאן הדגשנו ליפיד אחד, אשר עבר דקונבולוציה של האיזוטופים ונורמל לפי הסטנדרט הפנימי שלו. הרגע הראינו לכם כיצד לבודד ליפידים משמרים וכיצד לזהות את הליפיד של השמרים באמצעות ספקטרומטריית מסה עם יינון רסס אלקטרוסטטי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להימנע משימוש בפלסטיק ולשמור על הדגימה בטווח ריכוזים ליניארי.

שיטה זו היא גמישה למדי ובנימים רבים ניתן לשנות את הנפחים לפי הצורך. פרוטוקול מיצוי זה מתאים גם לשיטות אחרות של אנליזה של ליפידים, כגון כרומטוגרפיה בשכבה דקה ומספקטרוסקופיית מסות רב-ממדית. זהו כל התהליך.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.