כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא לבודד ולכמת פפטידים בתערובת מורכבת, המשמשים כסממנים (surrogates) עבור החלבון שאותו הם מייצגים. תחילה, חלבונים גדולים בתוך התערובת מעוכלים לפפטידים מרכיבים באמצעות אנזים כגון trypsin. לאחר מכן, האנליטים הפפטידיים המיועדים ותקן פנימי מסומן באיזוטופ יציב שהוסיפו למערכת, מועשרו באמצעות נוגדנים פפטידיים ספציפיים, המקובעים על חלקיקים מגנטיים מצופים בחלבון G בעקבות הבידוד.

הפפטידים המיועדים נשחררים מהחלקיקים המגנטיים ומנותחים באמצעות ספקטרומטריית מסות לצורך כימות ביחס לסטנדרט הפנימי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות אימונו-ספציפיות מסורתיות, הם מהירותה והיותה חסכונית יותר בבנייה של מספר רב של בדיקות. היא מתאפיינת בשיעורי הצלחה גבוהים וניתנת למילטפלקס (multiplexing) בקלות, כפי שיוצג בפרוטוקול להלן.

טכנאי במעבדה השתמש ב-10 µL פלסמה על קרח רטוב. העבירו את הדגימה ללוחית בארות עמוקה של 1000 µL וכסו בנייר פראקלון (parafilm) כדי למנוע התאיידות. כדי לדנטר את החלבונים, הוסיפו 20 µL של urea 9 M טרי ו-30 mM DTT לכל דגימה והדגירו למשך 30 דקות ב-37 °C. הוסיפו 3 µL של iodoacetamide 500 mM טרי לכל דגימה והדגירו למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. כעת דללו את ה-urea ל-0.6 M באמצעות tris 100 mM ב-pH 8, והוסיפו 10 µL של תמיסת מלאי trypsin בריכוז 1 µg/µL ליחס של 1:50 בין האנזים לסובסטרט.

לאחר דגירה של התגובה ב-37 °C למשך הלילה עם 3 µL של חומצה פורמית רכזumbrella לריכוז סופי של 1%, המשך בהוספת התקן של האיזוטופ היציב או מספר תקנים. בביצוע בדיקה מרובת רכיבים (multiplex assay), שטוף היטב את פלטת מחסניות ה-Oasis עם 500 µL של 0.1% חומצה פורמית ב-80% אצטוניטריל, תוך השלכת הנוזל שעבר דרך המחסנית. לאחר מכן, בצע שיווי משקל לפלטת המחסניות על ידי הוספת 500 µL של 0.1% חומצה פורמית במים והשלך את הנוזל שעבר דרך המחסנית.

טען את דגימות העיכול לפלטת המחסירת וכוונן את הוואקום כך שהזרימה תהיה איטית מאוד. שטוף שלוש פעמים עם 500 µL של 0.1% formic acid במים והשלך את הנוזל שעבר דרך העמודה. אלט את הפפטידים פעמיים עם 500 µL של 0.1% formic acid ב-80% acetonitrile, ולאחר מכן בצע ליאפיליזציה או ייבוש מהיר של האלואנט עד ליובש מוחלט. השב את הפפטידים המיובשים ב-50 µL של PBS בתוספת 0.03% Chaps. העבר את הדגימות לפלטת Kingfisher סטנדרטית בעלת 96 בארות. הוסף מיקרוגרם אחד של נוגדן ו-1.5 µL של חרוזי מגנט מצופים ב-protein G עבור כל מטרה. ערבב את החרוזים ב-Vortex לפני ההוספה.

כדי להבטיח שהחרוזים תלויים היטב, כסו את הפלטה בנייר אלומיניום והדגירו אותה למשך לילה במערבל סיבובי עדין. סובבו את הפלטה ב-400 RPM למשך 10 שניות כדי להסיר נוזלים מפני השטח של נייר האלומיניום.

הסירו את כיסוי הרדיד. טיפול בדגימה מבוצע על פלטפורמה אוטומטית מסוג Kingfisher. שטפו את החרוזים פעמיים עם 200 µL של PBS בתוספת 0.03% chaps, ופעם אחת עם 200 µL של מהילת 1:10 של PBS בתוספת 0.03% Chaps. כעת בצעו אלוציה של הפפטידים באמצעות 25 µL של 5% acetic acid בתוספת 0.03% chaps.

הנח את לוחית האלואוציה (elution plate) על מגנט והעבר את התוצרי אל לוחית 96 בארות, תוך הקפדה לא להעביר את שאריות החרוזים. כסה את הלוחית עם המצע העליון, והעבר לוחית זו המכילה את התוצרי למספק המסה המשולש או המרובע (triple or quadruple mass spectrometer) לצורך אנליזה. שיטת ה-MRM נבנית על ידי השגת ספקטרום מס טנדם של הפפטיד המבוקש, ולאחר מכן בחירה ואופטימיזציה של יוני השבירה (transition fragment ions) הטובים ביותר.

בדרך כלל, תצורה לניתוח MRM משתמשת במלכודת C 18 ובעמודי ניתוח עם שני פאזות ניידות. טענו 10 µL מהמדגם ובצעו אלוציה באמצעות גרדיאנט ליניארי. בצעו אינטגרציה של שטחי הפסגות עבור הפפטידים הקלים והכבדים, וחשבו את יחס שטחי הפסגות של הפפטיד הבל-מסומן אל הפפטיד המסומן בכל מדגם.

הפפטידים הקלים והכבדים נשטפים באותו זמן, וניתן לנטר מעברים מרובים עבור כל פפטיד. כדי לאשר את הזהות, נמדד שטח הפסגה של הפפטיד האנדוגני ביחס לשטח של התקן הפנימי כדי לספק מדד כמותי של הפפטיד המטרה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן יישום טכניקה זו במעבדה שלכם. ניתן להשתמש בה לכימות של כל חלבון רצוי, מה שהופך אותה למתאימה למגוון רחב של יישומים במחקר ביולוגי.