זיהוי של פנוטיפים עיכוב גדילה מושרה על ידי הבעת effectors סוג חיידקית השלישי שמרים

כדי להתחיל בפרוטוקול זה, בחר וקטור לביטוי של האפקטור הבקטריאלי המועדף עליך. במימן ובזן שמרים, הוקטור מותמר לאחר מכן לתאי שמרים. לאחר מכן, משרה את ביטוי האפקטור.

תאים שעברו אינדוקציה נליסו לצורך ניתוח western blot עוקב כדי לאמת את ביטוי האפקטור. לאחר אישור ביטוי האפקטור, התאים גודלו ודילולים סדרתיים של פי עשרה הונחתו על מצעים מדכאים ומעודדים. לבסוף, לאחר יומיים עד שלושה ימים, נותח גידול השמרים.

שלום, אני דו סולומון מהמעבדה של ד"ר גואידו צ'זה במחלקה למדעי הצמחים באוניברסיטת תל אביב. היום נראה לכם פרוצדורה לזיהוי פנוטיפים של עיכוב גדילה המושרים על ידי ביטוי של אפקטורים בקטריאליים מסוג 3 בשמרים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את התפקוד של אפקטורים מסוג 3 מחיידקים פתוגניים גרם-שליליים, וזהו כלי המסייע לנו בזיהוי מטרות האפקטור TIC.

אם כן, בואו נתחיל. יש לשקול ולבצע אופטימיזציה של מספר גורמים חשובים בעת תכנון מערכת שמרים המתאימה לביטוי של האפקטורים מסוג שלושה הרלוונטיים. הגורם הראשון הוא הפרומוטור המניע את ביטוי האפקטורים.

מכיוון שאפקטורים של חיידקים מסוג 3 עשויים להיות רעילים לתאי שמרים, יש להשתמש במקדם אינדוקביבי כדי לשלוט בביטוי שלהם. בניסוי זה נשתמש במקדם GAL one. הגורם השני הוא מספר העותקים של הגן המקודד לאפקטור.

רמות ביטוי גבוהות מושגות כאשר הגן האפקטור נישא על ידי פלסמיד two micron. ביטוי בינוני מושג באמצעות שימוש בפלסמיד המכיל צנטרומר, וביטוי נמוך מושג כאשר הגן האפקטור משולב בתוך הגנום של השמר באמצעות רקומבינציה הומולוגית. גורם שלישי שיש לקשוב לו הוא תג האפיטופ המשמש לאימות ביטוי החלבון במקרים שבהם אין נוגדנים זמינים נגד האפקטור הרלוונטי.

תגיות נפוצות המשמשות למטרה זו הן M hemagglutinin HA או flag, עבורן קיימים נוגדנים מסחריים אמינים. אנו ממליצים להשתמש בעותק אחד בלבד של התגית כדי למזער השפעות מזיקות לא רצויות על המבנה והפעילות של חלבון האפקטור. לבסוף, זן השמרים שבו ישתמשו לביטוי חייב להיות טרופי למסמן הבחירה של וקטור הביטוי.

על מנת לגדל תאי שמרים לטרנספורמציה, בחר קולונית שמרים מפיקת הגדלה טרייה והחדירה אותה לשלושה מיליליטר של YPD בתוך מבחנה מפוליפרופילן של 15 מיליליטר, ולאחר מכן בצע ערבוב ב-vortex. הנח את מבחנת התרבית לזמן קצר בתוך roller והדגר אותה למשך הלילה בטמפרטורה של 30 °C בסיבוב קבוע. למחרת בבוקר, הוצא את התרבית מה-roller ובצע סנטריפוגציה ב-800 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הצנטריפוגציה, הסר לחלוטין את הנוזל העליון (supernatant) ושחזר את התאים ב-1 mL של תמיסת Resus suspension buffer על ידי ערבוב ב-vortex במהירות מקסימלית למשך כ-10 שניות. עבור כל פלסמיד המיועד לטרנספורמציה ובנוסף עבור טרנספורמציית ביקורת, העבר 100 µL מתלי התאים למבחנה של מיקרוצנטריפוגה. הוסף 5 µL של DNA של זרע סלמון רב-גדילי, ו-250 עד 500 ng של DNA פלסמידי לכל מבחנה, למעט מבחנת הביקורת.

בשלב הבא, הוסיפו בזהירות 650 µL של תמיסת טרנספורמציה לכל מבחנה וערבבו במכשיר וורטקס. דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות על גלגלת. עם סיום הדגירה, הוסיפו 70 µL של DMSO לכל מבחנה וערבבו על ידי היפוך המבחנות 10 עד 15 פעמים כדי למנוע שבירה של התאים.

אין לנער את המבחנות בוורטקס. יש להניח את המבחנות באמבט מים שחומם מראש ל-42 °C ולהדגיר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, יש להוציא את המבחנות מאמבט המים ולהניחן מיד על קרח למשך שתי דקות.

לאחר שהמבחנות התקררו, קצרו את התאים באמצעות צנטריפוגציה, ולאחר מכן השתמשו בפיפטור כדי להסיר בזהירות את העלייה (supernatant) הצמיגית. השביו כל משקע (pellet) ב-150 µL של מים סטריליים מזוקקים פעמיים והפריסו את תרחיף התאים על צלחת עם המצע הסלקטיבי המתאים. השאירו את הצלחות פתוחות למשך שתי דקות ואפשרו להן להתייבש במכסה זרימה למינרית.

לאחר מכן, הניחו את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עד שלושה ימים לצמיחת תאי השמרים. להכנת תמצית חלבון, לחמן 3 mL של תוצר הדחיקה המתאים באמצעות מושבת שמרים מצלחת טרייה וערבבו במכשיר vortex. למחרת, הניחו לזמן קצר את מבחנת התרבית בגלגל (roller) בטמפרטורה של 30 °C.

הוצא את התרבית מהגלגלת וסבב במערך צנטריפוגה ב-800 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, השלך את הנוזל העליון (supernatant) ותלה את משקע התאים. ב-3 milliliters של DDW סטרילי, ערבב באמצעות וורטקס וסבב שוב בצנטריפוגה, השלך את הנוזל העליון ותלה שוב את התאים ב-3 milliliters של DDW סטרילי. כעת העבר 200 microliters מתליה התאים למבחנה חדשה של 15 milliliter המכילה 3 milliliters של מדיום השראה מתאים, וערבב באמצעות וורטקס.

הנח את המבחנה במכשיר גלגול (roller) והדגר למשך לילה ב-30 °C. בבוקר למחרת, העבר 1 mL מהתרבית (או יותר עבור תרביות בדחיפות נמוכה) למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה. אסוף את התאים על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-800 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר; מכאן ואילך, עבוד בתוך מנדף כימי כדי למנוע שאיפה של אדי Beamer capto ethanol רעילים.

הסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות פיפטה ושחזר את משקע התאים (cell pellet) ב-100 µL של תמיסת ליזיס קרה מאוד. ערבב בעוצמה באמצעות וורטקס והדגר על קרח למשך 30 דקות. במהלך ההדגרה של 30 הדקות, קבע את הנפח של חומצה כלורית נורמלית שש (6N HCl) הדרוש לטיטרציה של 100 µL של בופר ליזיס ל-pH שבין 9 ל-10.

כדי לבצע זאת, הוסיפו נפחים שונים של חומצה כלורית ל-100 µL של תמיסת ליזיס ב-10 מבחנות שונות, ובדקו את ה-pH של התמיסה באמצעות סרטית בדיקת pH בסיום הדגירה בנפח המתאים של חומצה כלורית לליזט וערבבו באמצעות וורטקס. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תמיסת דגימה בריכוז פי 3 (three x sample buffer) לליזט וערבבו באמצעות וורטקס, נקבו חור במכסה של מבחנת המיקרו-צנטריפוגה בעזרת מחט והרתיחו את תמיסת הליזט על בלוק חימום למשך חמש דקות. לאחר ההרתחה, הניחו לתמיסה להתרקער למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, ערבלו את תמיסת הליסאט במיקסר (vortex) וסבבו אותה בצנטריפוגה למשך 10 שניות. הליסאט מוכן כעת לאנליזה אימונולוגית של הדם כדי להכין את התאים לבדיקת נקודות (spotting assay). גדלו תרביות של 3 מיליליטר עבור כל זן, כפי שהודגם בעבר, ביום למחרת.

הכינו שתי צלחות המכילות מצע סינתטי מלא ללא לויצין. את המצע של צלחת אחת יש להעשיר ב-2% glucose ואת המצע של הצלחת השנייה ב-2% lactose וב-1% raffinose. ייבשו את הצלחות במבוף זרימה למינרית סטרילי בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

קצרו את התאים והשעיקו מחדש כל משקע תאים בשלושה מיליליטרים של DDW סטרילי. חזרו על שלב הצנטריפוגציה והשעיקו את התאים שוב בשלושה מיליליטרים של DDW סטרילי. קבעו את הצפיפות האופטית או ה-OD של כל תרבית, ולאחר מכן הכינו תלולות תאים בנפח של מיליליטר אחד עם OD 600 של אחת בתוך מבחנות מיקרופצ'ים סטריליות.

בשלב הבא, הכינו שלושה דילולות סדרתיות של פי עשרה מכל אחת מתרחיפי התאים, תוך שימוש בשלוש מיקרו-מבחנות סטריליות הממולאות ב-900 µL של DDW סטרילי. הניחו את הפלטות היבשות על רשת, ועבור כל תרבית, טפטפו 10 µL מהדילול הרביעי בשורה. לאחר הטפטוף, השאירו את הפלטות פתוחות במנדף למשך מספר דקות.

כאשר הנקודות יבשות, כסו את הצלחות והניחו אותן באינקובטור בטמפרטורה של 30 degree Celsius למשך יומיים עד שלושה ימים. כעת נציג תוצאות מבדיקת נקודות שמרים (yeast spotting assay) לזיהוי עיכוב בצמיחה. פנוטיפים שהושרפו על ידי ביטוי של אפקטורים מסוג 3 (type three effectors) כאן, האפקטורים מסוג 3, A-V-R-P-T-O hop, AA one one ו-AAV RE one של החיידק.

חלבונים של Pseudomonas riner המדמים פתוגנים של עגבניות בוטאו מתוך פלסמיד המכיל צנטרומר בזן של שמרים במצע מדכא; זני שמרים הנושאים פלסמיד לביטוי של A-V-R-P-T-O ו-HOP AA1 הראו צמיחה דומה לזן הביקורת המכיל וקטור ריק. בעוד ששמרים הנושאים את AV RE1 הראו צמיחה מופחתת מעט, ככל הנראה בשל דליפה של הפרומוטור GAL1 והציטוטוקסיות הגבוהה של AV RE1, בתנאי השראה, ביטוי של AV E1 או HOP AA1 גרם לפנוטיפ של עיכוב צמיחה דרסטי, שבא לידי ביטוי בהיעדר מושבות בכל דילול. לעומת זאת, ביטוי של A-V-R-P-T-O לא הפעיל כל השפעה מעכבת צמיחה.

הרגע הדגמנו כיצד לזהות פנוטיפים של עיכוב גדילה הנגרמים מהבעה של אפקטורים בקטריאליים מסוג III בשמרים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבחור בקפידה את וקטור ההבעה ואת זן זה, שכן לשניהם יכולה להיות השפעה דרמטית על התוצאות. בנוסף, זכרו להשתמש במושבות אלו שעברו טרנספורמציה טרייה בכל שלבי הפרוצדורה.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.