גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע את הצורה הכללית של קומפלקסים של חלבונים. מטרה זו מושגת על ידי רכישת נתוני ניידות יונים (ion mobility) בספקטרומטריית מסות עבור יונים של קומפלקסים של חלבונים, ומדידת ערכי זמן הסחיפה (drift time) של כל מצב טעינה. כשלב שני, תנאי הניסוי מתוּקפים על מנת להבטיח כי מדידות הניידות משקפות מבנים של חלבונים במצבם הטבעי (native).

בשלב הבא, ערכי זמן הסחף שנמדדו מקושרים לשטחים בחתך רוחב. התוצאות קובעות את ערכי שטח חתך ההתנגשות של חלבונים או קומפלקסים חלבוניים עם מבנים תלת-ממדיים לא ידועים. מידע זה מספק רמזים לגבי צורתם הכללית, אריזת תתי-היחידות והטופולוגיה שלהם.

שלום, אני אייזק לסקי מהמעבדה של Mic, המחלקה לכימיה ביולוגית במכון ויצמן למדע, ואני נעם קירשנבאום, גם אני מהמעבדה של Mic. היום נדגים פרוצדורה למדידת שטח חתך התנגשות של קומפלקסים חלבוניים באמצעות ספקטרומטריית מסות היברידית ומכשירי ניידות יונים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את הצורה הכללית ואת הארגון המרחבי של קומפלקסים חלבוניים.

אם כן, נתחיל. נוהל זה מתמקד בניתוח ניידות יונים במרחב המסה, ספקטרומטריית מסות, או ניתוח IMM MS של קומפלקסים של חלבונים. שלבי הכנת הדגימה, כיול המכשיר ונהלי האופטימיזציה של MS ו-tandem MS מודגמים בפרוטוקול JO קשור.

באופן כללי, פרוטוקול זה כולל ריכוזים נמוכים בסדר גודל של מיקרומולר של קומפלקס בבופר נדיף כגון ammonium acetate. בהינתן שמיקרוליטר אחד עד שניים נצרכים לכל נימי nano flow, הכין נפח מינימלי של 10 עד 20 מיקרוליטר כדי לאפשר אופטימיזציה של תנאי ה-MS. כדי להתחיל בהליך זה, הגדר את ה-traveling wave או את ה-T wave synap IMMS למצבי הפעולה הבאים: mobility tof, שבו ה-tri wave והלחצים נקבעים אוטומטית הן עבור IM והן עבור הפרדת יונים ב-time of flight, רכישת יונים חיוביים ו-V mode, הקובע את מסלול היונים דרך צינור המעוף וההחזרה; הפעל כאן את כל הגזים.

חנקן משמש להפרדה ב-IM וארגון משמש לאזורי המלכודת וההעברה. הערכים ההתחלתיים המומלצים הם ספיקת גז של 24 milliliters per minute עבור מכשיר ה-IMS ו-1.5 milliliters per minute עבור אזור המלכודת. לאחר מכן, הגדר את טווח רכישת יחס המטען למסה עבור קומפלקס חלבון לא ידוע.

השתמשו בתחילה בטווח מסות רחב, אותו ניתן יהיה לאחר מכן לצמצם לערכים הרצויים, והתאימו את פרופיל ה-MS בהתאם. עבור יעילות שידור מקסימלית של קומפלקסים גדולים, יש להגדיר את טווח המסות של הרכישה מ-1030 עד 2000 MA charge ratio ואת פרופיל ה-MS למצב auto. אחרת, ניתן להגדיר את הפרופיל בהתאם לתרשים המוצג.

בדקו את הגדרת ה-RF ובמידת הצורך, התאימו אותה לערכים המתאימים לקומפלקסים חלבונים גדולים כפי שמוצג. לאחר מכן, טענו את הדגימה, החילו מתח קפילרי ולחץ זרימה ננומטרי נמוך. ברגע שהריסוס התחיל, נסו להפחית את לחץ הזרימה הננומטרי לערך מינימלי.

בנוסף, התאם את מיקום הנימי ביחס לחרוט, והתאם את פרמטרי הרכישה של ה-MS כדי לקבל ספקטרום MS בעל רזולוציה טובה. בצע אופטימיזציה למדרג הלחצים לאורך המכשיר ובחרוט הדגימה, וכן להגדרות הפוטנציאל של מלכודת ה-bias של חרוט המיצוי וההעברה, כפי שפורט בפרוטוקול ה-JoVE הנלווה. למרות שפרמטרים אלו תלויים בדגימה, להלן התנאים ששימשו לרכישת ספקטראי MS של מסות ברזל שונות, החל מפפטידים ועד לקומפלקסים של חלבונים.

יונים גדולים דורשים אנרגיות התנגשות ומתח bias גבוהים יותר. כמו כן, מומלץ להעלות את הלחץ האחורי (back pressure) בניתוח של קומפלקסים חלבונים גדולים כדי למזער את הפעלתו של הקומפלקס. נסו להפחית בהדרגה, במדרגות של כ-10 וולט, את מתחי ה-sample cone extraction, ה-cone trap וה-bias, מבלי לשנות את מיקום הפיק.

לאחר קבלת ספקטרום מס אופטימלי, יש להתאים את זמן הסחיפה (drift time) או את פרופיל ה-IM בעת ניתוח של מקבצי חלבונים. תנאים אופטימליים למדידות מס וניידות הן לרוב אינם תואמים. לכן, חשוב להשיג את האיזון הנכון ביניהם.

באופן כללי, יש לאפתימלי את תרשים ניידות הברזל כך שהפיקים יהיו מפוזרים על פני כל טווח זמן הסחיפה ופרופיל הפיק יהיה חלק. כאשר מתקרבים להתפלגות גאוסית, אסימטריה משמעותית של הפיק עשויה להעיד על הפרדה לקויה של קונפורמציות מרובות. ניתן לכוון את מהירות גל ה-T, גובה גל ה-T וקצב זרימת הגז ב-IMS כדי לאפתימלי את הפרדת הניידות. הגדלת מהירות גל ה-T מרחיבה את פרופיל התפלגות זמן הסחיפה.

בעוד שערכי גובה גל-T גבוהים יותר מצמצמים אותו, באופן דומה הגדלת זרימת הגז ב-IMS, החל ממינימום של 10 milliliters per minute, מסיטה את פרופיל זמן הסחיפה לעבר ערכים גבוהים יותר כדי לאפטמיזציה של ספקטרום ניידות היונים. על ידי קיבוע שניים משלושת המשתנים ואופטימיזציה של השלישי, הגדירו את מהירות גל-T ל-250 meters per second ואת זרימת הגז ל-24 milliliters per minute. לאחר מכן, כנקודת התחלה, הגדירו את הגובה ל-3 volts והגדילו אותו באופן מדורג בתוספות של 1 volt.

בעת שימוש במתחי הסט (bias voltages) גבוהים, מומלץ להפחית את לחץ הגז ב-IMS ובדרך זו לאפשר את הורדת מתח ההסט. כתוצאה מכך, ההפעלה והדיסוציאציה של תרכובות מורכבות יפחתו. אפקט גלילה (rollover effect) עלול להופיע כאשר התנאים אינם אופטימליים, וניכר כפסה זהה בחלק הראשון של ספקטרום זמני הסחף ובקצה הזנב.

כאשר היונים אינם חוצים את התקן ה-IAM, ייתכן שמסלולם ייארך יותר מהזמן הדרוש לשחרור חבילת הברזל הבאה אל תא הניידות (mobility cell). כתוצאה מכך, צרור חדש של יונים משתחרר מאזור המלכוד לפני שחבילה קודמת הגיעה לאזור הדוחף (pusher region). כדי למנוע ארטיפקט זה, יש להגדיל את גובה ה-T-wave ולהפחית את מהירות ה-T-wave ואת הלחץ ב-IMS.

בנוסף, ניתן לכוונן את זמן שחרור המלכודת. יתרה מכך, חשוב לוודא שגובה גל-T של ההעברה מוגדר ללפחות חמישה וולטים. זאת גם כדי למנוע דליפה של יונים לעבר תא ה-IMS.

יש לשמור על גובה מלכודת הניידות (mobility trap) ברמות maximal. מהירות נמוכה ואמפליטודה גבוהה של גלי T להעברה עלולות להוביל להופעת גלים (rippling) בפרופיל התפלגות זמן הסחף. ארטיפקט זה מתרחש כאשר ההפרדה לפי ניידות של יונים אינה נשמרת לאורך אזורי ההעברה והאזורים הקשים, עקב סנכרון חלקי בין תדירות הדחיפה לבין מהירות גל ה-T להעברה.

כדי לבטל השפעה זו, יש להתאים את זמן הדחיפה (pusher time) או את מהירות גל ה-T של ההעברה. מכיוון שתדר הדחיפה קשור לטווח המסה, ארטיפקט זה עלול להופיע שוב כאשר פרמטר זה משתנה.

גובה גל T מפעיל השפעה מינורית. עם זאת, הפחתתו עשויה לסייע גם בביטול תנודות (ripples). לאחר אופטימיזציה של הפרמטרים שהוזכרו לעיל, ניתן לרכוש את נתוני ה-IMMS כדי להשיג רזולוציה גבוהה.

קומפלקסים של חלבונים ב-MS.Peaks מופעלים לעיתים קרובות בתוך ספקטרומטר המסות כדי לקדם את הסרתם של שאריות מים ומרכיבי חוצץ. עם זאת, אם אנרגיית ההפעלה עולה מעבר לערך סף, עלול להתרחש פתילה חלקית היוצרת מספר מצבי ביניים, שאינם צפויים להתאימו למבנה המקורי במצב תמיסתי. כתוצאה מכך, שיאו של זמן הסחף עשוי לסטות ולהתרחב, מה שמשקף את האוכלוסייה ההומוגנית של מבנים פתולים.

על מנת להשיג נתוני זמן סחף (drift time) העקביים עם מבנים בשלב התמיסות, חיוני לבקר בקפידה את המתחים המשמשים להאצת יונים לפני הפרדה ב-IM; לכן, יש להעלות את מתח הנייר (capillary) והקונוס באופן מדורג תוך ניטור ההשפעה על ספקטרום זמן הסחף. יתרה מכך, עבור רזולוציית MS גבוהה, עדיף להעלות את מתח ההעברה (transfer) מאשר את מתח המלכודת (trap). מכשיר ה-IM ממוקם ראשון, ואחריו אזור ההעברה ואנליזר ה-TOF.

מאחר שההפעלה מתבצעת לאחר מדידת ה-IM, הן אינן מושפעות ממנה, בעוד שניתן להגביר את דיוק ה-MS כדי להבטיח שאיסוף הנתונים יבוצע בתנאים השומרים על המבנה הטבעי של הקומפלקס, חשוב לאסוף נתונים על פני טווח של תנאי תמיסה ותנאים ניסיוניים במקום להיצמד למערכת אחת מותאמת של פרמטרים. מסיבה זו, הגבירו את מתח ההתנגשות במלכוד (trap collision voltage) באופן מדורג ואספו נתונים במרווחים של 10 volt תוך ניטור ההשפעה על פרופיל ניידות הברזל. לבסוף, כדי לזהות את הקונפורמציות הפרומות ולהעריך את הנתונים שנאספו, גרמו ידנית לדיסוציאציה של קומפלקס החלבון על ידי טיטול הדגימה בחומצה אצטית בטווח pH של שתיים עד שבע והקליטו את הנתונים; לאחר מכן, עברו לניתוח הנתונים במערכת T wave IMS, כאשר שטחי החתך הוגדרו בגישת כיול זמן סחף (drift time calibration), תוך שימוש בחלבוני Cain בעלי ערכי חתך ידועים.

ראשית, הכין תמיסות חלבון כיול דנטורטיות בריכוז של 10 micromolar לכל אחת. השתמש ב-equine cytochrome C horse, heart myoglobin ו-bovine ubiquitin ביחס נפחים של 49:49:0.2 של מים, מתנול וחומצה אצטית. לאחר מכן, רכוש נתוני IMMS עבור חלבוני הכיול תחת אותם תנאי מכשיר בדיוק שבהם נעשה שימוש עבור החלבון המטרה או קומפלקס החלבונים; שמור על כל ערכי המתח והלחץ זהים כדי לשמר את הגדרות ההפרדה של ה-IM.

לאחר רכישת הנתונים, חלץ את ערך זמן הסחף (drift time) הניסויי עבור כל מטען. עבור חלבוני ה-Cain, תקן את זמני הסחף המכוילים T prime D באמצעות המשוואה הבאה, כאשר MOVZ הוא יחס המטען הראשי של היון שנצפה, ו-C הוא מקדם העיכוב של מחזור העבודה המשופר (EDC delay coefficient). ערכו, הנמצא בדרך כלל בין 1.4 ל-1.6, תלוי במכשיר.

ערך ה-EDC מופיע בהגדרות רכישת המערכת one, בלשונית הגדרת רכישה (acquisition setup), תחת תיקון של כל חתכי הרוחב של כיול עבורทั้ง מצב הטעינה של הברזל והמסה המופחתת. כאשר omega C הוא חתך הרוחב המתוקן, omega הוא חתך הרוחב מהספרות, Z הוא מצב הטעינה של הברזל, M הוא המשקל המולקולרי של יון השרשרת, ו-MG הוא המשקל המולקולרי של הברזל.

גז רקע, שהוא בדרך כלל חנקן, עלילה של T prime D מול עלילה של omega C. העקומה המתקבלת תואמת למשוואה הבאה. ניתן להפיק את הפרמטרים X ו-A על ידי התאמת הגרף לקשר ליניארי. השיפוע X תואם לגורם הפרופורציה האקספוננציאלי, ו-A מייצג את הקבוע שנקבע בהתאמה.

חשבו את מקדם מתאם ההתאמה R squared. ערכים מקובלים עבור R squared הם גדולים מ-0.95. ערך נמוך יותר של מקדם המתאם עשוי לנבוע מפריסה חלקית של החלבון או מהתיישנות הדגימה.

תנאים ניסיוניים שונים ששימשו עבור חלבונים בקליברים שונים, ספקטרום רועש ועיבוד נתונים לא מלא או שגיאת חישוב. תקנו את זמן הסחיפה (drift time) באמצעות הגורם המעריכי X שנקבע, ואמתו את החישובים שלכם על ידי שרטוט מחדש של omega C מול T prime D. הגדירו שוב את מקדם המתאם. ניתן לצפות לערכים הגבוהים מ-0.95. בדומה לשלבים שתוארו קודם לכן, תקנו את זמן הסחיפה שנמדד עבור החלבון המטרה או קומפלקס החלבון, וכיילו את זמן הסחיפה של החלבון המטרה או קומפלקס החלבון באמצעות הגורם המעריכי X שחושב. חשבו את omega של החלבון המטרה או קומפלקס החלבון באמצעות הקבוע A שנקבע מההתאמה (fit), כאשר omega שווה ל-a TD. חזרו על שלבים אלה עבור כל תנאי ניסיוני.

בעת הגדרת שטח החתך של חלבון לא ידוע או של קומפלקס חלבונים, אנו ממליצים לחזור על כל ניסוי לפחות שלוש פעמים ולחשב את סטיית התקן של מדידות שחזור אלו לאחר קביעת ערכי שטח החתך להתנגשות (collision cross-section). גישות מידול מיושמות על מנת לחזות את הטופולוגיה או את סידורי המבנה של הקומפלקס. הדבר נעשה על ידי התאמת ערכי שטח החתך להתנגשות מהניסוי לערכי Omega שחושבו in silico ממבני מודל שהופקו; באופן כללי, תחום זה עדיין נמצא בשלביו הראשונים ונדרש פיתוח נוסף כדי להפוך גישה זו לגנרית וישימה על מגוון רחב של קומפלקסים.

מוצג כאן ייצוג שטח של הצורה הטטראמרית של המוגלובין בקר. קומפלקס ההמוגלובין, המשמש להובלת חמצן, יכול לשמש כדוגמה לגישה שהוזכרה לעיל. המוגלובין הוא קומפלקס חלבוני טטראמרי המורכב משתי תתי-יחידות אלפא ושתי תתי-יחידות בטא, הצבועות בכחול ובאדום בהתאמה, אשר יוצרות דימר של דימרים מסוג אלפא-בטא.

ספקטרום ה-IMMS של המוגלובין מוצג כאן. ספקטרום ה-IM ms שנרכש של הקומפלקס חושף התפלגות של סדרת מטענים עיקרית התואמת לקומפלקס השלם, וסדרת מטענים מינורית התואמת למסות של הדימר alpha beta ושל תת-היחידות המונומריות alpha ו-beta. ה-CCS התאורטי והנמדג של הצורות השונות של המוגלובין מוצגים כאן.

ערכי זמן הסחף (Drift time) שהתקבלו עבור מספר מצבי מטען של הצורות הדימריות והטטรมריות שימשו לחישוב ערכי האומגה. אלו הושוו לערכים התאורטיים. בהינתן שקומפלקס טטรมרי בעל שלוש אפשרויות להתארגנות: מחזית, דיהדרלית או אריזות דמויות שרשרת.

על ידי חישוב העלייה ב-omega במעבר מדימר לטטראמר, ניתן לחזות את הארגון המבני. מחקרים קודמים וניסויים שביצענו הראו מתאם חזק בין ccss שנמדדו לבין שטחי פני השטח של חלבונים שנגזרו מנתוני מבנה גבישי. מתאם זה יכול לשמש לחישוב העלייה הצפויה בשטח הפנים של טטראמר בהשוואה לדימר עבור צורות האריזה השונות.

פעולה זו מתבצעת על ידי התייחסות לכל תת-יחידה כאובייקט אספרי. הרכבה דמוית שרשרת תגדיל את ה-CCS של הטטראמר בערך פי שניים, בעוד שאריזה מסוג C four או D two תביא לעלייה של כ-1.5 ו-1.67 בהתאמה. היחס המחושב בין ערכי ה-CCS שנמדדו עבור צורות הטטראמר וה-DME של המוגלובין היה 1.57 פלוס או מינוס 0.03.

מספר זה ממחיש כי המבנה הטבעי אינו מאורגן באופן ליניארי, אלא מסודר בצורה דחוסה יותר, כטטראמר מעגלי או דיהדרלי. כאשר חזרו על אותו חישוב במבנה הגבישי המפוענח של hemoglobin, היחס בין שטחי הפנים של הצורות הטטראמריות לצורות ה-DME היה 1.63, מה שמתאים לסימטריה מסוג D2. באופן ברור, מודל גיאומטרי זה היה פשוט, ותתי-יחידות של חלבון אינן סфеריות גרילד.

עם זאת, חישוב זה מדגים את הפוטנציאל המרגש ש-IMMS מציע לחשיפת האריזה של קומפלקסים עם מבנים ברזולוציה גבוהה שאינה ידועה. הרגשתי לכם כיצד למדוד את זמן הסחף של החלבון ושל קומפלקסי החלבונים, וכיצד לחשב את ערכי שטח חתך ההתנגשות שלהם. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לרכוש את נתוני ה-IMMS עבור חלבוני הכיול תוך שימוש בדיוק באותם תנאים שבהם נעשה שימוש עבור החלבון או קומפלקסי החלבונים הנבדקים.

יתרה מכך, אנו ממליצים מאוד לחזור על ניסויים אלה לפחות שלוש פעמים ולחשב את סטיית התקן של מדידות אלו בtriplicate. זהו זה. תודה שצפיתם בהם ובהצלחה בניסויים שלכם.