השלמה Fluorescence bimolecular
15 באפריל 2011
Subcellular לוקליזציה של חלבונים חשוב בקביעת הרגולציה במרחב ובזמן של איתות התא. כאן אנו מתארים השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) כשיטה פשוטה לניטור אינטראקציות המרחבי של חלבונים בתא.
ניסוי זה נועד לקבוע האם שני חלבונים מקיימים אינטראקציה בתאים ולהגדיר היבטים של אתרי האינטראקציה הזו. ראשית, תאים עוברים טרנספקציה עם קונסטרוקטים של ביטוי המקודדים לשני החלבונים המדוברים, כאשר אחד מהם מחובר לקצה הטרמינלי של חלבון פלואורסצנטי מפוצלח והשני מחובר לקצה ה-C המשלים של החלבון הפלואורסצנטי המפוצלח. לאחר מתן זמן לתאים שעברו טרנספקציה לפתח אות פלואורסצנטי בתרבית, קומפלקסי החלבונים מודגשים באמצעות דימות ואימונו-בלוטינג.
לאחר מכן, התמונות שנאספו מיוצאות לתוכנת עיבוד תמונה כגון Image J כדי לכמת את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת לתא. בניסוי מבוקר, תוצאות BIFC יכולות להדגים אינטראקציות בין חלבונים ואת הלוקליזציה של קומפלקסים אלה, כגון המפגש בין דומייני SH3 של חלבון ה-scaffold לבין הדומיין העשיר בפרולין של PI3K2β. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון colocalization, immunoprecipitation ו-FRET, הוא ש-BFC מאפשרת לוקליזציה מרחבית של אינטראקציות חולפות חלשות יותר בתא. בנוסף, שיטה זו אינה דורשת עיבוד תמונות נרחב לאחר הצילום, כפי שנדרש ב-FRET.
שיטה זו יכולה לתת מענה לשאלות מרכזיות בתחום העברת אותות, כגון האם חלבונים X ו-Y מקיים אינטראקציה, ואם כן, מהם המדורים הספציפיים שבהם ממוקמים קומפלקסים אלו בתא? באופן כללי, מתחילים בשיטה זו עלולים להתקשות כיוון שלא בחרו בתצורה הנכונה לביטוי הביופסיה שלהם. חלבונים מסומנים בעלי עניין התחילו בבחירת אחד מהפלואורופורים הרבים עבור חלבוני ה-BIFC המאוחדים.
יש לקחת בחשבון כי הקצוות האמינו והקרבוקסי של Venus מסוגלים להוות קומפלקס ב-37 °C, בעוד שפגמנטים של Y-F-P-B-I-F-C דורשים דגירה מוקדמת ב-30 °C. תכננו וקטורי ביטוי להוספת תג לחלבונים הנבדקים תוך התחשבות באופן שבו חיבור פגמנטים של BIFC עשוי להשפיע על תפקוד החלבונים הנבדקים. לדוגמה, חלבונים ממשפחת RAs ו-GTP a's עוברים מודיפיקציה ליפידית בקצה הקרבוקסי ואינם יכולים להיות מסומנים בתג בקצה זה מבלי לשבש מודיפיקציה זו.
בצעו תמיד ניסויי פיילוט כדי לקבוע את תנאי התעתוק. כמו כן, עקבו אחר התאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לזהות את הזמן האופטימלי להתפתחות האות. לאחר מכן, בצעו אנליזת western blot כדי לאשר ביטוי שווה של המבנים.
חשוב לבצע צביעה אימונוהיסטוכימית עבור תג ה-HA או ה-flag כדי לוודא שהוספת פרגמנטי ה-BIFC אינה משנה את הלוקליזציה התאית של החלבונים הנבדקים בכל לוח דגימה. זרע 1.3 times 10 של חמישה תאים לכל לוח עם תחתית זכוכית ולשני בארות של לוח בעל שש בארות, ואפשר לתאים לשקוע למשך לילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. למחרת, הכן את ה-DNAs לטרנספקציה באמצעות ליפקטומיה או שיטה מועדפת אחרת.
ראשית, דללו את ה-DNA ב-250 µL של DMEM ללא סרום כביקורת טרנספקציה. הוסיפו CFP ביחס של 1:50, המהווה את הכמות של סך כל ה-BIFC DNAs שלכם. כעת דללו את הליפוזומים ב-250 µL של DMEM ללא סרום, תוך שימוש ב-10 µL של ליפוזומים לכל 1 µg של DNA.
ערבבו את ה-DNA ואת הדילוציות של הליפידים והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. שטפו את התאים פעמיים ב-DMEM חם ללא סרום. הוסיפו שני מיליליטרים של DMEM ללא סרום לכל פלטה בעגית עם תחתית זכוכית או לכל באר בצלחת בעלת שש בארות.
לאחר מכן, חלקו באופן שווה כל תערובת טרנספקציה בין צלחת בעלת תחתית זכוכית אחת לבין שני בארות של פלטה בעלת שש בארות. הדגרימו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש שעות. לבסוף, הסירו את מדיום הטרנספקציה והחליפו אותו במדיום DMEM מלא בתוספת 10% FBS.
דגרו את התאים למשך הזמן שנקבע בניסויי פיילוט כדי להשיג את רמות הביטוי הדרושות של החלבונים המבוקשים. בחנו את התאים שעברו טרנספקציה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפיפוסקלית כדי לוודא שהבקרה החיובית פלואורסצנטית. שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS לצורך דימוג תאים חיים.
העבירו את התאים למצע ללא צבעי אינדיקטור. לצורך דימוי תאים מקובעים, הוסיפו 2%para formaldehyde והניחו על קרח למשך 10 דקות.
לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS, כסו אותם ב-1 mL של PBS ואחסנו בחושך בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן בצעו ליזיס מיידי של התאים בצלחת בעלת שש בארות. עבור אנליזות Western blot, חשוב שכל התאים יוכנו בו-זמנית כדי שתאי הליזיס יהיו מייצגים של תאי הדימוי. בצעו Western blot כדי לוודא שחלבוני התג מובעים ברמות שוות.
בעת דימיוג תאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי, חשוב לשמור על הגדרות קבועות לאורך כל הניסוי כדי שהפלואורסצנציה תהיה ניתנת להשוואה בין הדגימות. ודאו שאתם מדייגים תאים בודדים שבהם הפיקסלים אינם רוויים. מכיוון ש-CFP נכלל כבקרת טרנספקציה, בחרו רק תאים חיוביים ל-CFP לצורך ניתוח אותות BIFC.
כמת את הפלואורסצנציה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות כגון Image J. פתח את קבצי התמונות ב-Image J. עבור לתפריט Analyze ולאחר מכן ל-Set Measurements. בתיבת ה-Measurements, סמן את תיבות הבחירה עבור Area ו-Mean Gray Value. שים לב שבדוגמה זו, תמונות הוורידים צבעו בצבע מדמה ירוק ותמונות ה-CFP צבעו בצבע מדמה אדום.
באמצעות כלי הבחירה החופשית (freehand selection tool), שרטטו קו מתאר מסביב לקצה התא כולו בערוץ ה-CFP והשאירו את קו המתאר זה במקומו. עברו לערוץ ה-YFP. עברו לתפריט ניתוח (analyze) ומדדו את ערך האפור הממוצע (mean gray value), המשקף את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת לכל תא בכל תמונה.
שרטטו עיגול בערוץ ה-YFP באזור שאינו מכיל תא. בצעו מדידה של אזור זה כרקע. החסירו את הרקע מכל תמונה.
לבסוף, כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת עבור אוכלוסיית תאים, חשבו את הממוצע של ערך הדרגה הממוצע פחות הרקע עבור כל התאים שצולמו בדגימה אחת. באופן אידיאלי, יש לכמת 60 תאים לאורך שלושה ניסויים. חלבון הפיגום הרב-דומייני Intersecting מווסת את הישרדות הנוירונים באמצעות ויסות של מחלקה חדשה של PI3K class II, ה-PI3KC2β. דומייני ה-SH3 של Intersecting מקיימים אינטראקציה עם האזור העשיר בפרולין בטרמינוס האמינו של PI3KC2β. טרנספקציה של Intersecting מתויג ב-VN יחד עם PI3KC2β מתויג ב-VC מביאה לאות פלואורסצנטי בערוץ ה-YFP, הצבוע בצבע ירוק מלאכותי ומעיד על היווצרות קומפלקס.
CFP, שצבעו כאן באופן מלאכותי באדום, משמש כבקרה לסימון תאים שעברו טרנספקציה. מוטציות בדומיין העשיר בפרולין של PI three KC two beta, אשר פוגעות בשיקוע משותף של intersecting ו-PI three KC two beta, מפחיתות את אות ה-BIFC. הבדל זה באות ה-BIFC אינו נובע מהבדלים בביטוי של חלבוני הטיפוס הפראי וה-PA PI three K. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בשלושה ימים אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, יש לזכור להריץ את הבקרות המתאימות ולבדוק את ביטוי החלבון כדי להבטיח שההבדלים באות ה-BC נובעים מהבדלים ביצירת הקומפלקס ולא מהביטוי בעקבות פרוצדורה זו.
ניתן לבצע טכניקות אחרות, כגון共תהודה פלסמה שטחית (Surface Plasmon Resonance) על הדגימות, כדי לענות על שאלות כגון מהן זיקות הקשירה השונות של קומפלקסים אלו זה לזה?
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט את השימוש בשיטת השלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית (BiFC) לחקר אינטראקציות בין חלבונים ואת הלוקליזציה התת-תאית שלהם בתאים חיים. BiFC מאפשרת ויזואליזציה של המקום והעובדה ששני חלבונים מקיימים אינטראקציה על ידי שחזור של אות פלואורסצנטי רק בעת היווצרות קומפלקס, ובכך מציעה יתרונות על פני שיטות מסורתיות כגון שיקוע חיסוני (immunoprecipitation), קו-לוקליזציה ו-FRET.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- אינטראקציות בין חלבונים
- דימוי פלואורסצנטי
רקע
- הבנת ההתפלגות המרחבית של קומפלקסים של אותים היא קריטית לפירוש התפקודים התאיים שלהם.
- שיטות קונבנציונליות כמו immunoprecipitation חסרות רזולוציה מרחבית.
- שיטת BiFC משתמשת בחלבונים פלורסצנטיים מפוצלים המחוברים לחלבונים של עניין; פלורסצנציה מתרחשת רק כאשר החלבונים מקיימים אינטראקציה.
- לשיטות חלופיות (co-localization, FRET, BRET) יש מגבלות כגון רקע גבוה, מורכבות טכנית או חוסר במידע מרחבי.
מטרת המחקר
- לקביעה אם שני חלבונים מקיימים אינטראקציה בתוך תאים.
- לזיהוי התאים התת-תאיים שבהם מתרחשות אינטראקציות אלו.
- לספק שיטה חסונה בעלת רזולוציה מרחבית לגילוי אינטראקציות חלבוניות חלשות או זמניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציה של תאים עם קונסטרוקטים המקודדים לחלבונים רצויים המחוברים למקטעים משלימים של חלבון פלואורסצנטי.
- פיתוח פלואורסצנציה בתרבית, ולאחריה דימיון (imaging) ואימונובלוטינג.
- כימות של עוצמת הפלואורסצנציה לתא באמצעות תוכנת דימיון (למשל, ImageJ).
- שימוש בביקורות כגון CFP לבדיקת יעילות הטרנספקציה ו-western blotting לאימות הביטוי.
- אופטימיזציה של תנאי הטרנספקציה והביטוי, כולל ניסויי פיילוט ושיקולי מיקום של התג.
תוצאות עיקריות
- שיטת BiFC מאפשרת ויזואליזציה מוצלחת של אינטראקציות בין חלבונים ושל המיקום התת-תאי שלהם.
- הוכחה אינטראקציה בין דומייני SH3 של intersectin לבין הדומיין העשיר בפרולין של PI3KC2β, כאשר פלואורסצנציה מעידה על היווצרות קומפלקס.
- מוטציות המשבשות את האינטראקציה מפחיתות את אות ה-BiFC, ובכך מאששות את הספציפיות.
- בקרות מתאימות מבטיחות כי הבדלים בעוצמת האות משקפים היווצרות קומפלקס ולא רמות ביטוי.
מסקנות
- BiFC היא טכניקה עוצמתית לזיהוי ואיתור של קומפלקסים חלבוניים בתאים.
- היא מתאימה במיוחד לחקר אינטראקציות חלשות או חולפות.
- תכנון ניסיוני קפדני ובקרות הן חיוניות לצורך פרשנות מהימנה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שילימה פלואורסצנטית בי-מולקולרית (BiFC) מאפשרת ויזואליזציה ישירה של אינטראקציות בין חלבונים ומיקום התוצרין התת-תאי שלהם, ובכך נותנת מענה לפער קריטי בתיקוף מטרות בעל רזולוציה מרחבית. יכולת זו מגבירה את הביטחון בחיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הבחנה בין אינטראקציות מולקולריות אמיתיות לבין רעש רקע, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים באופן יסודי. נקודות החוזק של BiFC בזיהוי קומפלקסים חלשים או חולפים הופכות אותה לנכס בעל ערך למיון פורטפוליו ולקבלת החלטות בשלבים מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה בעלת רזולוציה מרחבית של אינטראקציות בין חלבונים בתוך תאים חיים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי אישור ספציפיות האינטראקציה והמדור (compartmentalization).
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין אינטראקציות ישירות לבין ארטיפקטים של קו-לוקליזציה (co-localization).
- משפר את הביטחון החזוי לקידום מטרות בתוך צינור הגילוי (discovery pipeline).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות תאיים שעברו ולידציה לצורך סריקה של מודולטורים של אינטראקציות בשלבים הבאים.
- מספק פלטי פלואורסצנציה כמותיים לפיתוח תבחינים (assays) סטנדרטיים.
- מפחית את דרישות העיבוד הבחור (post-processing) בהשוואה ל-FRET, ובכך מייעל את יכולת ההרחבה של זרימת העבודה.
- מאפשר זיהוי מהימן של אינטראקציות חלשות או חולפות לצורך הערכת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי מיפוי מיקום האינטראקציה במדורים רלוונטיים פיזיולוגית.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אישור מנגנונים מולקולריים in situ.
- מספק נתונים מותאמי-סיכון לפיתוח ביומרקרים טרנסלציונליים כאשר הם נתמכים על ידי ספציפיות האינטראקציה.
- משפר את הפחתת הסיכונים החזויה לבחירת מועמדים פרה-קלינית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטת ה-BiFC משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מטרות מוקדם, דרך פיתוח בדיקות ועד למחקר פרה-קליני, ומספקת פלטפורמה רב-פעמית לניתוח אינטראקציות בפירוט מרחבי.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות ויזואליזציה של קומפלקסים חלבוניים ספציפיים בתאים חיים.
- סריקה: מספק קריאות פלואורסצנציה כמותיות הניתנות לשחזור עבור סטנדרטיזציה של בדיקות וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת לתא, ובכך תומך בניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר נתוני אינטראקציות מולקולריות למדורות רלוונטיות למחלה, ובכך מסייע בגיבוש אסטרטגיות לבומקרים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת בעלת יישום רחב למגוון מחקרי אינטראקציות בין חלבונים בתוכניות מו"פ שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה עם מינימום עיבוד לאחר הבדיקה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) וקידום יעיל של פורטפוליו המשאבים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות מאומתות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בשיבוט מולקולרי, טרנספקציה של תאים ודימוי פלואורסצנטי.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה קונפוקלית ולתוכנה לדימוי כמותי (למשל, ImageJ).
- דורש ניסויי בקרה קפדניים לאימות ביטוי ומיקום התג.
- יש לשקול את מיקום התג כדי למנוע פגיעה בתפקוד החלבון או במיקומו.
- מוגבל על ידי הרכבה בלתי הפיכה של הפלואורופור והיעדר ניתוח קינטי בזמן אמת.
