איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

כדי לבחון את האינטראקציה בין שני חלבונים, יש לשבט את שני הגנים הרלוונטיים לתוך וקטורי BF שלנו באמצעות טכניקת Gateway cloning. תסמיכים אלו מוחדרים לתוך Agrobacterium GV3101. תרביות חיידקי GV3101 המכילות את שני התסמיכים יומספו ויבוצע להם co-infiltration לתוך העלים.

אם שני חלבוני המועמדות מקיימים אינטראקציה זה עם זה, ניתן להבחין באות YFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המטרה העיקרית של טכניקת BFC היא לבחון אינטראקציה בין שני חלבונים. ב-vavo, יצרנו סדרה של וקטורי BFC ו-two-hybrid תואמי Gateway, המספקים לחוקרים כלים קלים לשימוש לביצוע בדיקות BFC ו-two-hybrid.

בסרטון זה, נדגים את קלות השימוש במערכת ה-BFC שלנו. כדי לבחון את החלבון ואת האינטראקציות בין חלבונים באופן שאינו פולשני במערכת ביטוי. ראשית, עליכם להכין תרבית חיידקים מסוג GV 3 1 0 1.

יש לבחור מושבה בודדת מהצלחית ולהחדירה לחמישה מבחנות עם מצע YEB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. לאחר מכן, יש לערבב תרביות אלו למשך הלילה בטמפרטורה של 28 °C. מהירות הערבוב היא 200 rpm.

התרביות החיידקיות צריכות להיות מוכנות למחר בבוקר. ודאו שהחיידקים לא גדלו יתר על המידה. הוציאו את התרביות מהאינקובטור והעבירו דגימה אחת מכל תרבית לתוך מבחנת צנטריפוגה סטרילית בנפח 1.5 mL.

הניחו את מבחנות הצנטריפוגה בצנטריפוגה שולחנית. סובבו את החיידקים ב-1000 G למשך 10 Minutes בטמפרטורת החדר, והשליכו את העלייה. לאחר מכן, שטפו את המשקע על ידי הוספת נפח שווה של מצע חדירה וערבוב על ידי הקשה קלה מספר פעמים.

חזור על שלב השטיפה פעמיים נוספות. דבר זה חשוב מכיוון שהוא מסייע בהסרת שאריות האנטיביוטיקה מהתווך הבקטריאלי, אשר גורמות למות התאים הצמחיים לאחר חדירה. לאחר השטיפה האחרונה, השהה מחדש את המשקע ב-0.5 mL של תווך חדירה. מדוד OD600 של תרחופים בקטריאליים אלו באמצעות ספקטרופוטומטר, תוך שימוש בתווך החדירה כביקורת רקע.

לאחר מדידת ה-OD, יש להתאים את ה-OD באמצעות מצע חלחול. ה-OD הסופי צריך להיות בין 1 ל-1.2. יש להכין את כל תרחיפי החיידקים לפני המעבר לשלב הבא.

העבירו כמות שווה של תרחיפי חיידקים התואמים לשני חלבוני המועמדים שלכם וערבבו אותם בתוך מבחנה חדשה בנפח 1.5 מ"ל. תערובת החיידקים השלילית מוכנה כעת להסנפה. הכינו את כל השילובים ואל תשכחו לכלול ביקורת שלילית. יש להשתמש בצמחי Nicotiana benthamiana בני חמישה עד שישה שבועות לצורך ההסנפה.

ניתן להוציא את הצמחים מחדר הגידול ולהניח אותם על משטח למשך שעה אחת לפני ההסננה כדי לפתוח את הstomata. פעולה זו תסייע בתהליך ההסננה. שאבו כ-100 µL של חיידקים תלויים בתמיסת Resus.

ערבבו בתוך מזרק עם קצה מחליק ללא מחט. הניחו את קצה המזרק בחלקו התחתון של העלה. תמכו בחלקו העליון של הברך בעזרת האצבע.

בדרך כלל, לחצו למיטה על הבוכנה. אתם אמורים לראות את הנוזל מפיץ את עצמו דרך העלה ככל שמרגישים שהחללים האוויריים של המזופיל הופכים לדחוסים יותר לאחר החדירה. סמנו את העלה שחדרה אליו החומר באמצעות טוש. אחרת, לאחר יומיים, לא תוכלו לזהות את העלה שחלחל אליו הנוזל. אם עליכם לבצע חדירה עם תערובת חיידקים שונה, ודאו שאתם מרססים את הכפפות ב-50% ethanol או מחליפים כפפות בין חדירה אחת לשנייה.

נסו להשאיר מרווח של מטר אחד בין ההסנפיות כדי למנוע זיהום צולב. יש לנטר את אותות ה-PFA בכל 24 שעות החל מהסנפירה ועד לחמישה ימים. ניתן להשתמש בשתי שרוולי כיסוי בגדלים שונים כדי להחזיק את הדגימה.

ראשית, הניחו טיפה אחת של מי דה-יוניזציה על כיסוי של תאית חריץ. לאחר מכן, גזרו חתיכה קטנה של רקמת סכין בתוך האזור שחלחל. השתדלו להימנע מווריד בתוך הדגימה.

הניחו את רקמת הסכין החתוכה במים על השקופית. לאחר מכן, כסו אותה באמצעות כיסוי זכוכית קטן יותר ולחצו בעדינות. כעת ניתן לצפות בדגימה תחת המיקרוסקופ. כאן אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקאלי NACA T CSS P two כדי להמחיש את אות ה-BIFC.

ניתן להשתמש גם במיקרוסקופ פלואורסצנציה רגיל. מיקרוסקופ קונפוקאלי מספק תמונות טובות יותר ומזהה אותות חלשים. ניתן להשתמש במדד ה-YFP כדי לזהות את אותות ה-VFC במערכת NCAs P two זו.

ניתן פשוט ללחוץ פעמיים על הגדרת ה-YFP המקדימה כאן, דבר שיפעיל באופן אוטומטי את העירור ויגדיר את טווח זיהוי הפליטה. אם אתם משתמשים במערכת אחרת, אנא עיינו במדריך כדי להגדיר את הפרמטרים כראוי. אנו מקווים כי לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו לבצע BFCE לבדיקת אינטראקציות בין חלבונים באמצעות מערכת הביטוי unbe MI Transcend.

ניתן להחיל פרוצדורה זו גם על צמחי טבק ו-AY. וקטורי ה-BFC שלנו מכילים גם תגי HA ו-flag בהתאמה, כך שניתן לבצע גם co IP כדי לאמת את האינטראקציות במידת הצורך.