ביצוע ניסויים אישית microarray MicroRNA

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ביצוע ניסוי של מערך זעיר (microarray) עבור micro RNA. מטרה זו מושגת תחילה על ידי רכישת שקופיות של מערך זעיר מודפס המכילות ספרייה של גששים (probes) ל-micro RNA, והכנת דגימות RNA באיכות ובכמות מתאימות. לאחר מכן, ה-RNA ודגימת DNA של ביקורת מסומנים בצבעים פלואורסצנטיים.

לאחר מכן, מוסיפים את חומצות הגרעין המסומנות לפלטת מיקרו-מערך (microarray) לצורך היברידיזציה. לבסוף, שוטפים וסורקים את פלטת המיקרו-מערך ולאחר מכן מחדשים אותה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את הביטוי של microRNAs ברחבי הגנום, באמצעות ניתוח של עצימות ההיברידיזציה של הגששים (probes) האישיים לכל microRNA על גבי הפלטה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ביטוי הגנים, כגון השאלה כיצד תנאים פיזיולוגיים נורמליים או מצבים פתולוגיים משפיעים באופן דיפרנציאלי על דרישות הביטוי במיקרו-מערכים בקנה מידה גלובלי. איכות ייצור המיקרו-מערך היא אחד הגורמים הקריטיים ביותר להצלחת ניסוי במיקרו-מערך. לאחר בידוד RNA בשיטה המשמרת RNA קטן ותליתו בריכוז השווה או הגבוה מ-2 mg/mL, סמנו את ה-RNA בנפח תגובה של 20 µL על ידי ערבוב של כ-25 µg של RNA כולל עם 0.5 µg של 5' P-C-U-D-Y 5 4 7 3' בבופר 1X HEPs בתוספת T4 RNA Ligase 1D TT ו-ATP. אם זמין פחות RNA, הפחיתו את כמות ה-RNA ואת היקף התגובה.

אם ה-RNA דלול מאוד, יש להוסיף נשא כגון שמרים או TRNA כדי לסייע בשקיעה, ולהדגיר את התגובה על קרח בתוך מקרר למשך שעתיים עד 24 שעות. לאחר מכן, יש להוסיף נתרקה אצטט לריכוז של 0.3 M, ולאחר מכן שלושה נפחים של אתנול ולהשקיע את ה-RNA למשך לילה בטמפרטורה של 20- °C. בשימוש ראשון בעגילות, יש לבצע היברידיזציה מוקדמת (pre hybridize) בתמיסה מסוננת של 3X SSC, 0.1% SDS ו-0.2% BSA למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C.

בשלב הבא, טבול את השקופיות במים מספר פעמים. לאחר מכן, טבול אותן באיסופרופנול, ייבש את השקופיות באמצעות צנטריפוגה עם מתאם לשקופיות ב-100 $\times$g למשך חמש דקות ב-22 °C. שטוף את פסי ההרמה במים.

לאחר מכן, בתוך אתנול ולפני ייבוש באוויר, הנח שקופית בתוך בסיס של תא היברידיזציה של מיקרו-מערך (microarray) וסליפ הרמה (lifter slip) מעל השקופית, כך שסליפ ההרמה יכסה את אזור הגששים ואת הפסים הלבנים שלו. השקה את השקופית בחושך, סבב למטה (spin down) את ה-RNA המסומן ששקע, שטוף אותו פעם אחת ב-70% ethanol ויבש את המשקע באוויר. המשקע צריך להיות בעל צבע אדמדם.

הכינו תמיסת היברידיזציה באמצעות שימוש בנפח של 1/15 עד 1/100 מה-DNA של רצף הייחוס המסומן והמטוהיר עבור כל דגימת RNA. המיסו את משקע ה-RNA לחלוטין עם כ-60 microliters של תמיסת ההיברידיזציה כדי להבטיח שתמיסת ההיברידיזציה לא תתייבש. במהלך הדגירה, הוסיפו 20 microliters של מים לכל אחת מבארות הלחות בבסיס תא ההיברידיזציה של המערך (microarray).

הוסיפו תערובת של RNA מסומן ו-DNA ייחוס לשקף. בעזרת קצה של פיפטה דקה, געו בעדינות בקצה של שקף ההרמה (lifter slip) ובאמצעות יניקה, אפשרו לתמיסה להיכנס לחלל שבין שקף ההרמה לשקף.

מקמו את כיסוי תא ההיברידיזציה על הבסיס. לאחר מכן, אטמו את התא באמצעות תפסים ממתכת. הכניסו את התא כולו לתוך השקית הפלסטית המגיעה עם קסטת התא.

לבסוף, הניחו את קסטת התא בתוך מיכל עם נייר סופג רטוב. לאחר מכן, כסו את המיכל בניילון נפה והכניסו אותו למדגרה לתרביות תאים לחה בטמפרטורה של 37 °C למשך כ-24 שעות. כדי לעבד את השקופיות לאחר ההיברידיזציה, פרקו את קסטות התא אחת אחת ושקעו שקופית, יחד עם זכוכית ההרמה שלה, בתוך 2X SSC בטמפרטורה של 22 °C.

פס ה-lifter יסתלק באופן טבעי מהשקופית; שטפו את השקופיות פעמיים ב-0.8 XSSC, ולאחר מכן שלוש פעמים ב-0.4 XSSC, למשך זמן כולל של דקה עד שתיים. ייבשו את השקופיות באמצעות צנטריפוגה עם מתאם לשקופיות. לאחר מכן, סרקו את השקופיות בעזרת סורק מיקרו-מערכים (microarray scanner) והשתמשו בתוכנה כגון blue fuse כדי לכמת את העוצמות בקבצי התמונה.

יש לבחון את הנקודות הבודדות כדי להחריג נקודות חריגות, שנובעות בדרך כלל מהדפסת שקופיות נקבוביות או מטיפול בשקופיות לאחר ההibrדיזציה. לצורך ניתוח והצגת נתונים, השתמשו בתוכנות כגון gene springing ו-excel כדי להשתמש במערך המיקרוניซק (microarray) שוב. הסירו את החומר מהשקופית על ידי שטיפתה במים, ולאחר מכן טבילה בכלי צביעה המכיל 1 mM NaOH ו-0.1 XSSC שחוממו מראש ל-62 °C למשך 10 עד 20 דקות.

חזור על הדגירה פעם שנייה. שטוף את השקופיות מספר פעמים במים למשך עד 60 דקות עם ניעור עדין ב-22 degrees Celsius. ייבש את השקופיות באמצעות צנטריפוגה ואחסן ב-22 degrees Celsius.

ניתן להשתמש בשקופיות ללא היברידיזציה מקדימה. איור זה מציג תמונה סרוקה של מערך מיקרו (microarray) המדגימה אותי היברידיזציה חזקים ומדויקים מאוד. נקודות אדומות נבעו מהיברידיזציה של ה-DNA הייחוס, נקודות ירוקות נבעו מדגימת RNA המסומנת ב-DY 5 47, והנקודות הצהובות נבעו מהיברידיזציה של ה-DNA וה-RNA גם יחד לאותם פרובים.

מקדמי המתאם של פירסון בין שיכורים טכניים של היברידיזציית מיקרומערך הם כ-0.99, דבר המעיד על הדירות מצוינת. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ביצוע ניסוי מיקרומערך מותאם אישית, לא רק לצורך כימות של micronase, אלא גם לצורך כימות של סוגים אחרים של חומצות גרעין, כגון mRNAs.