שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

שלום, שמי קן פראדיסו. אני עובד עבור לינג גנג וו בתוכנית הפנימית של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, הממוקם בקמפוס בתסדה של ה-NIH. אני אציג בפניכם את הטכניקות להקלטה פרה-סינפטית של ה-calyx held באמצעות Patch clamping.

כדי להכין את רקמת המוח, אנו מוציאים את המוח מהחולדה. אנו מניחים את המוח בתוך תמיסה זו, שהיא תמיסה קרה מאוד (בטמפרטורת קרח) עם ריכוז סידן נמוך, המבעבעת בקרבוגן (carbogen) כדי להבטיח אספקת חמצן רציפה למוח. כמו כן, התמיסה חייבת להיות קרה מאוד כדי למזער את מידת הנזק.

כעת המוח נמצא בתמיסה זו. נוציא אותו ונחתוך אותו באופן מתאים כך שניתן יהיה להניח אותו על התושבת, ונקבע אותו לתושבת באמצעות Sano correlate או דבק מהיר. לאחר מכן, נמלא את התא בתמיסת סידן נמוך קרה מאוד, נהסמיח אותה (bubble), נניח אותה על הוibratome ונחתוך פרוסות בעובי של 180 עד 190 microns, בתדירות להב של 70 hertz ובמהירות התקדמות קדימה של 0.01 עד 0.02 millimeters per second. כלומר, 10 עד 20 microns per second.

לאחר ביצוע כל חיתוך, אנו מעבירים את הפרוסות מהסליין הקר על קרח לתא זה, המכיל תמיסת סידן רגילה. זוהי אותה תמיסה שבה אנו מבצעים את ההקלטה, והיא נמצאת בטמפרטורה פיזיולוגית של 37 °C. לאחר מכן, אנו מניחים את הפרוסות כאן לצורך התאוששות.

הוא נשאר כאן למשך חצי שעה עד שעה לפני ביצוע ניסויי הפיזיולוגיה. כעת, יש לי כאן את המוח ואני עומד להוציאו מהתמיסה. לצורכי הדגמה, זהו מוח גדול יותר.

זהו נתח מחולול חולדה בגיל P 20. נהפוך אותו. גזע המוח הוא החלק שמעניין אותנו.

אם כן, האזור הזה כאן למטה והגביע נשמרו בערך באזור הזה ממש. לכן, מה שנעשה הוא לחתוך את שאר המוח, לבודד את גזע המוח, ולאחר מכן להכין את גזע המוח עבור תא החיתוך. אוקיי, נחתוך את שאר המוח כדי לבודד רק את גזע המוח.

אני הופך את הדגימה כדי להדגים היכן אנו נמצאים. בדרך כלל לא היינו פועלים בדרך זו, ושוב, ניתן פשוט להסיר את כל החלק הזה. לאחר ההחזרה למצב המקורי, בידלנו את גזע המוח ואנו מבצעים חתך נוסף בדיוק שם.

בסדר, זהו זה. זהו גזע המוח. ה-Calyx of Held נמצא ממש שם ושם.

זהו גזע המוח. שוב, נדחף אותו מעט לאחור. נגזור צד אחד של המוח הקטן (cerebellum), וזה יאפשר לגזע המוח לשבת הצידה באופן זה.

השקענו כמות קטנה של דבק אקרילי מסוג Sano, ובזמן שהשארנו אותו במצב שכיבה, מילאנו במהירות קרח קר, תמיסת סידן בריכוז נמוך וקרה. הכניסו את קו החמצן פנימה במהירות האפשרית. כעת נרים אותו ונעבירו אותו אל הוויברטור.

אנו מקדמים את המכשיר במהירות כדי להגיע לתחילת המוח, ולאחר מכן, ברגע שהגענו לתחילת המוח, אנו מורידים את המהירות ל-0.01 millimeters per second. כלומר, 10 micros per second. כך שהתנועה היא בקצב איטי ביותר.

החלק הראשון של המוח הוא החלק שבו נמצא ה-mtb, שהוא ה-medial nucleus of the trapezoid body. וזהו החלק המכיל את, אוקיי, ברגע שזה נמצא בפיפטת ההעברה, אני מנסה להביא אותו קרוב ככל האפשר לקצה הפיפטה. והנה פרוסת המוח, ואני מעביר אותה במהירות לתא זה, המכיל תמיסת הקלטה סטנדרטית עם רמות סידן רגילות וגם בטמפרטורה גבוהה יותר.

וזה יאפשר לפרוסות להתאושש לאחר הליכי החיתוך, כך שיהיו מוכנות לניסויי פיזיולוגיה. אוקיי, מכאן והלאה, הפעולות יחזרו על עצמן שוב ושוב. הציוד הבא הוא מה שאשתמש בו כדי לבצע את ה-patch clamping.

ברשותנו מיקרוסקופ זקוף עם שולחן קבוע. השולחן קבוע, כפי שציינתי, ולכן המיקרוסקופ נע תחתיו באמצעות מניפולטור. אנו משתמשים במיקרו-מניפולטור של Wigs and Newman כדי להחזיק את השולחן; עבור יחידת הראש של המגבר, אנו משתמשים במגבר patch clamp מדגם EPC 10 מבית HEKA.

בנוסף, עליי לציין שאנו משתמשים ב-DIC עם אור אינפרא-אדום. לכן יש לנו כאן מצלמת IR, וכל מה שנראה יופיע על המסך בעודנו מחפשים CAEs. מגבר ה-patch clamp נשלט על ידי התוכנה הזו, הנקראת Pulse, שגם היא מבית Heca, והיא תשלוט במגבר ובכל ניסוי הפיזיולוגיה.

התוצאות יופיעו על מסך זה. הגביע שנחזיק הוא טרמינל פרה-סינפטי גדול, ובשל גודלו, הוא מאפשר לנו לבצע patch פיזי על הטרמינל. לפיכך, אנו יכולים לבצע הקלטות פרה-סינפטיות, וזהו דבר ייחודי למדי, במיוחד במערכת העצבים המרכזית (CNS).

בדרך זו אנו יכולים למדוד תעלות סידן המופעלות באופן פרה-סינפטי. בנוסף, אנו יכולים למדוד פעילות של פוטנציאל פעולה אם נרצה לגרות את העצב המוביל אל ה-calyx. במעבדה זו אנו מודדים תהליך הנקרא אקזוציטוזה, שהוא התאחות של שלפוחיות המכילות מוליכים עצביים עם הממברנה.

כעת, כאשר שלפוחיות אלה מתמזגות עם הממברנה בתהליך הנקרא אקסוציטוזה, הן מוסיפות ממברנה לקצה הסינפטי, וניתן למדוד זאת כשינוי בקיבוליות (capacitance). נקבל עלייה בקיבוליות כתוצאה מהוספת ממברנה לקצה, לכן הניסויים שאציג היום הם מדידות קיבוליות, כאשר במצב פרה-סינפטי הממברנה מוסרת. שכן לא ניתן להמשיך להוסיף ממברנה ללא הפסקה, אלא יש להסיר חלק ממנה.

תהליך זה נקרא אנדוציטוזה או ספיגה ממברנלית. אנו יכולים למדוד גם זאת, והמדד יהיה ירידה ברמת הקיבוליות, ונדגים דוגמאות לכך בהמשך. כעת, הדבר מאפשר לנו לנטר את הפעילות של תעלות סידן וכן לנטר וללמוד על חלק מהחלבונים המעורבים באקסוציטוזה ובאנדוציטוזה.

ניתן להוסיף חומרים כגון פפטידים כדי לחסום חלבונים המעורבים באקסו- או אנדוציטוזיס. ניתן להשתמש גם ברעלנים הממלאים תפקיד דומה. כמו כן, ניתן לווסת את כמויות הסידן הנכנסות למסוף, ובכך לבחון לעומק את תהליך האקסוציטוזיס, שחרור הנוירוטרנסמיטור, וכן את ספיגת הממברנה העוקבת לאירוע זה.

זוהי המבחנה המכילה את תמיסת ההקלטה התוך-תאית שלנו. אנו מכינים אותה מראש ולאחר מכן מקפיאים אותה, ובדרך כלל ניתן להשתמש בה למשך מספר שבועות עד חודש לפני שיהיה צורך להכין תמיסה חדשה. שוב, חשבנו על כך רגע לפני ביצוע ההקלטות, ותמיד תמצאו כמות מסוימת של חלקיקי אבק או סוגים אחרים של פסולת שייכנסו למבחנה שלכם.

ניתן לפעול באחת משתי דרכים: ניתן להוציא את התמיסה ולסנן אותה, או לסובב אותה בצנטריפוגה למשך דקה או שתיים ולאחר מכן להוציא את התמיסה, ולהשאיר את החלק התחתון המכיל שרידים וחומרים אחרים. אני מעדיף לסובב אותה בצנטריפוגה, ואעשה זאת כעת.

זוהי המבחנה המכילה את התמיסה התוך-תאית שלנו. היא הופשרה. אנו נסביב אותה במשך כשתי עד שלוש דקות בצנטריפוגה קטנה, וזה אמור להספיק כדי להוציא כל חלקיקי אבק גדולים מהתמיסה.

כעת אני פשוט מושך את השכבה העליונה, התמיסה שסובבנו זה עתה, תוך הקפדה לא לערבב אותה, ומעביר אותה למבחנה נקייה, כאשר אני שואב כ-90% ממנה. אני מנסה שוב לא להגיע לכמות הקטנה שנותרה. לכן אעצור בערך בנקודה זו.

אני מניח זאת על קרח באופן מיידי כדי שיישאר קר במהלך הניסוי. זהו שלב חשוב מאוד. זוהי אחת מהפיפטות שלנו.

אנו משתמשים בזה להקלטות תוך-תאיות. מדובר בזכוכית סיליקה בעלת דפנות עבות, קוטר חיצוני של שני מילימטרים וקוטר פנימי של 1.16 מילימטרים. ראשית, אנו מבצעים מילוי אחורי של הפחית.

לכן אנו מפעילים יניקה, מכניסים את הפ pipette לתוך תמיסת ההקלטה ומפעילים יניקה כדי לנסות למלא את קצה הפ pipette, שאינו יתמלא בשום דרך אחרת. לאחר שעשינו זאת, אנו לוקחים צינור קפילרי וממלאים את שאר האלקטרודה על ידי תפיסת החלק האחורי של הפ pipette. זוהי טכניקה פיזיולוגית סטנדרטית המבוצעת על ידי תנועת נקישה מהירה.

קיים סיכון לשבירה של קצה הפיפטה, אך אם לא תעשו זאת, לרוב ייווצרו בועות אוויר. כעת נניח אותה על מעמד הפיפטה, המחובר לראש המגבר של ה-patch clamp. שם נמצא תיל של כסף כלוריד.

חוט כסוף כלורי בא במגע עם התמיסה התו-תאית, דבר המאפשר לנו למדוד את הפעילות החשמלית בטרמינל הפרה-סינפטי. לפיכך, אנו מחפשים פרוסה המכילה מספר רב של CAEs; אנו שואפים לצפיפות גבוהה של CAEs.

כעת אנו מחפשים את הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז, המכונה MNTB, ושם נמצא הטרמינל המהווה את ה-calyx app, או שזהו ה-calyx app. לכן, מה שאנו עושים הוא להתחיל לסרוק את הפרוסה. לדוגמה, שם יש לנו calyx שנמצא מעט עמוק מהפני השטח ואין הרבה שניתן להיאחז בו, לכן אנו פשוט ממשיכים לסרוק לרוחבה.

זהו הגביע שאליו אנו שואפים להגיע. סימנתי שני סימנים על המסך, שם תמוקם הפפיתה. ניתן לראות את חלק הגביע שבו אמוקם את הפפיתה כשתרד למטה.

אפעיל לחץ חיובי כך שיידחף כלפי מעלה אל מול הגביע (calyx), ולאחר מכן אשחרר את הלחץ החיובי. הגביע ידחף אז כלפי מעלה אל מול הפיפטה, ובנקודה זו אפעיל שאיבה עדינה מאוד ואנסה לשאוב ולדחוף את הממברנה או לגרום לממברנה להיסגר על קצה הפיפטה. בסדר, שחררתי את הלחץ החיובי.

וכעת אחיל שאיבה. כאן אנו מחילים פולס של 5 millivolt, או למעשה פולס של 4 millivolt. אוקיי, זהו זה. אוקיי.

כעת אנו מורידים את פוטנציאל הממברנה למינוס 80, כדי לבטל את הזינוק העובר המהיר. כעת נעבור למצב תא שלם (whole cell). אחיל שאיבה עדינה ואנסה להגיע למצב תא שלם.

טרנסיאנטים אלו של הטענה מעידים על כך שהפיפטה והתא הם כעת רציפים, ושהתקבלה הקלטה מלאה. זהו עוד צילום נהדר. הגוון האדום הבהיר יותר שם היה עקומת הקיבוליות, וניתן לראות שיש שם קפיצה פתאומית ולאחר מכן היא ירדה.

ובכן, הרגשתי עבורכם כעת את הטכניקות הבסיסיות להשגת הקלטות מטרמינל פרה-סינפטי מסוג calyx. הראיתי לכם כיצד להכין את הפרוסות המכילות את הגרעין המדיאלי של גוף הטרפזואיד (medial nucleus of the trapezoid body). שם תוכלו למצוא את ה-calyxes.

והראיתי לכם את הטכניקות לבחינת הפרוסות. אתם תעברו על כל אחת מהפרוסות, ותחפשו את הפרוסה שבה נמצא מספר הגדול ביותר של caly על פני השטח. לאחר מכן, תחפשו את ממבט ה-caly הגדול ביותר שתוכלו למצוא ותבצעו עליו רישום patch clamp.

כמו כן, הדגמתי בפניכם את הטכניקות להקלטת patch clamp, ואלו הן טכניקות סטנדרטיות להקלטת patch clamp.