תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע טרנספורמציה לתאי שמרים באמצעות ספריית מערך של DNA של פלזמה. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול של כמות מתאימה של תאי שמרים. לאחר מכן, תאי השמרים מטופלים בליתיום אצטט כדי להפוך אותם לקומפטנטיים לטרנספורמציית DNA.

בשלב הבא, בצע טרנספורמציה לתאי ה-e כשירים על ידי ערבובם עם DNA. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא בחירה וניתוח של הטרנספורמנטים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את השפעות ה-plasma DNA על פנוטיפים של שמרים באמצעות בדיקות spotting של שמרים ו/או מיקרוסקופיה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים, כגון טרנספורמציות סטנדרטיות של שמרים, הוא שהיא מאפשרת טרנספורמציה של מספר רב של פלסמידים שונים לתאי שמרים באופן אוטומטי. פרוטוקול טרנספורמציה של שמרים בתפוקה גבוהה זה תוכנן עבור 10 פלטות של 96 בארות, אך ניתן להגדילו או להקטינו בהתאם. עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר, המפתח להצלחה הוא שמירה על ארגון של כל הפלטות והריאגנטים.

כדי למנוע בלבול לאחר תחילת הניסוי, בפרוטוקול זה יעשה שימוש במערכת טיפול בנוזלים מהירה בלוחות מסוג A biobot. לתחילת העבודה, יש להעביר מנות (aliquot) של 5 עד 10 µL של DNA מפלסמה מספריית פלסמידים של שמרים למספר מערכים לתוך כל באער בלוחות 96 באערים בעלי תחתית עגולה. יש להניח את לוחות ה-96 באערים ללא כיסוי בתוך מנדף נקי למשך הלילה לייבוש.

לאחר מכן, זרעו זן תחת בחינה לתוך 200 milliliters של מצע שמרים פפטיד דקסטרוז או YPD בתוך בקבוק Lin Meyer עם מחיצות בנפח 500 milliliters; דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עם ניעור. למחרת בבוקר, דללו את הזן תחת בחינה עד ל-OD 600 של 0.1 בשני ליטרים של מצע YPD לצמיחה אופטימלית. גדלו תרביות של עד ליטר אחד בבקבוקים נפרדים עם מחיצות בנפח 2.8 liters.

נער את הבקבוקים במשך ארבע עד שש שעות בטמפרטורה של 30 °C עד שהתרביות מגיעות ל-OD 600 של 0.8 עד 1.0. כאשר תרבית השמרים הגיעה ל-OD 600 של 0.8 עד 1.0, קצור את התאים באמצעות צנטריפוגציה. מלא ארבעה מבחנות קוניות חד-פעמיות בנפח 225 milliliter בתרבית, וסובב ב-3000 RPM למשך חמש דקות בצנטריפוגה שולחנית.

שפכו את העילאי (supernatant) מכל מבחנה. הוסיפו תרבית נוספת לאותן מבחנות וסובבו שוב בצנטריפוגה, חזרו על הפעולה במידת הצורך עד להסבה של כל התאים. שטפו כל משקע תאים ב-50 milliliters של מים מזוקקים שעברו אוטוקלאב וערבבו מחדש באמצעות וורטקס (vortexing).

שילו את התאים בתוך מבחנה קונית אחת של 225 milliliters וסובבו במהירות של 3000 RPM למשך חמש דקות. לאחר הסרת ה-S supernatant, שטפו את התאים ב-100 milliliters של תמיסת lithium acetate. סובבו שוב במהירות של 3000 RPM למשך חמש דקות.

הסר את ה-SNA ותלה מחדש את משקע התאים ב-70 milliliters של תמיסת lithium acetate. ערבב במכשיר vortex במהירות גבוהה למשך כ-30 שניות עד שהמשקע נתלה מחדש באופן מלא. דגור עם ניעור ב-30 degrees Celsius למשך 30 דקות.

בשלב הבא, הוסיפו beta me capto ethanol לריכוז של 0.1 molar והדגרירו עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות נוספות. לאחר הדגירה של 30 דקות, הוסיפו שתי מיליליטר של DNA מזרה של סלמון, שהורתח וקורר, לתערובת התאים. שפכו את תערובת התאים לפלטה בעלת באר אחת הניתנת לאוטוקלבה, ולאחר מכן הסירו כל משקע שנוצר, כיוון שזה עלול להפריע לשלבי הפיפטינג בהמשך.

באמצעות ה-biobot rapid plate, העבירו מנה של 50 µL מתערובת התאים לכל באר בארבעת לוחות ה-96 באערים שהוכנו מראש ומכילים plasma DNA; אין לערבב. דגרו את הלוחות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ללא ניעור, בזמן שהתאים מדגרים.

הכינו 200 מיליליטר של תמיסת PEG DMSO lithium acetate. ערבבו 160 מיליליטר של 50% PEG 33, 50, 20 מיליליטר של DMSO ו-20 מיליליטר של lithium acetate בריכוז one molar. חשוב להכין תמיסה זו רגע לפני השימוש.

הוסיפו 125 µL של תמיסת PEG lithium acetate DMSO לכל דגימה. ערבבו היטב על ידי שאיבה והזרקה של תרחיף התאים שמונה פעמים. הדגרימו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ללא ניעור.

בשלב הבא, בצעו הלם תרמי לתאים בטמפרטורה של 42 degrees Celsius למשך 15 דקות באינקובטור יבש; אין לערום את הפלטות לאחר ההלם התרמי. סובבו את הפלטות באמצעות מתאמי צנטריפוגה המתאימים לפלטות של 96 בארות. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו את תמיסת ה-PEG על ידי היפוך הפלטות מעל דלי פסולת. לאחר מכן, ייבשו את הפלטות ההפוכות בעזרת נייר סופג.

כדי להסיר נוזלים ששאריותיהם נותרו, התאים יישארו בתחתית הבארות. שטפו את התאים על ידי הוספת 200 µL של מצע גידול מינימלי לכל בארה. סובבו את הפלטות שוב במערכת הצנטריפוגה.

הסיר את הנוזל העליון על ידי הפיכת המערכת מעל דלי פסולת וספיגה באמצעות נייר סופג. הוסף 200 µL של מצע מינימלי לכל באר באמצעות מפזר פלטות מהיר, והדגר בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים ללא ניעור. לאחר יומיים, קולוניות קטנות של תאים אמורות להתחיל להיווצר בתחתית כל באר שבה בוצע הטרנספורקציה בהצלחה.

כדי להכין את הבדיקה לזריעת נבגים (Spatting assay), יש להעביר תחילה 200 µL של מצע מינימלי מבוסס OSE לכל באער של פלטת 96 באערים שטוחה ותחתונית חדשה. לאחר מכן, יש לערבב כל באער בפלטת הטרנספורמציה על ידי שאיבה ושחרור של תרחיף התאים שמונה פעמים באמצעות פיפטה רב-ערוצית מהירה.

החדירו לכל באער בלוחית הראפינוז חמישה מיקרולטרים של תערובת תאים מלוחית הטרנספורמציה, והדגרירו בטמפרטורה של 30 °C למשך יום אחד. למחרת, אמורות להופיע מושבות קטנות בתחתית כל באער.

בצעו את בדיגת הנקודות (spotting assay) בתוך המCב, ועקרו את ה-96-pin replicator או את ה-frogger על ידי שריפה בלהבה. ערבבו את המושבות באמצעות ה-frogger ולאחר מכן העבירו נקודות מהמושבות אל מצעים סלקטיביים. לאחר ההעברה, השאירו את המצעים להתייבש בתוך המבב למשך 5 עד 10 דקות.

דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עד שלושה ימים. מוצגים כאן תוצאות מייצגות של סריקת ביטוי-יתר של פלסמיד בשמרים לזיהוי מדכאים (suppressors) ומעצבים (enhancers) של רעילות TDP 43. TDP 43 הוא חלבון אנושי המעורב בפתוגנזה של סקלרוסיס צדיים שרירי (amyotrophic lateral sclerosis) או מחלת לו גריג; ביטוי של TDP 43 בתאי שמרים מוביל לאגרגציה ולציטוטוקסיות.

צלחות אלו מציגות מושבות עם פלסמיד T DP 43 משולב הניתן להשראה על ידי גלקטוז, אשר עברו גם טרנספורמציה עם פלסמידים מספריית ביטוי ה-ORF של גן ה-flex. המושבות כאן מופיעות בצבע אדום מכיוון שהזן כולל מוטציה הגורמת להצטברות של פיגמנט אדום. הצלחת משמאל מכילה גלוקוז, המדכא את הביטוי של T DP 43 או של פלסמידי גן ה-flex.

המונח בצלחת מימין מכיל גלקטוז, המשרה את הביטוי של TDP 43 ושל ה-O Fs בפלסמידי הגן flex. חץ ראשון ירוק מצביע על מושבה שעברה טרנספורמציה עם פלסמיד המדכא את הרעילות של TDP 43, כפי שניתן לראות מצמיחה מהירה יותר ומושבות דחוסות יותר. חץ ראשון אדום מצביע על מושבה שעברה טרנספורמציה עם פלסמיד המגביר את הרעילות של TDP 43, כפי שניתן לראות מצמיחה איטית יותר ומושבות פחות דחוסות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תקישו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לבצע טרנספורמציה לספרייה של plasma DNAs מתאים.