RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans

מטרת פרוצדורה זו היא לזהות רגולטורים פוסט-עובריים של ביטוי חלבונים ומיקומם ב-C elegance, באמצעות סריקה גנומית מבוססת RNAi וחלבונים מסומנים פלואורסצנטית. לאחר בניית זן הסריקה המתאים, נבחרת ספריית RNAi. השלב הראשון של הפרוצדורה הוא אריזת השיבוטים מהספרייה אל תוך חיידקים.

לאחר מכן נבחרים החיידקים, גודלים ומוזנים לנמטודות *C. elegans* בשלבים שונים. לאחר מתן זמן גדילה של 72 שעות לנמטודות, הן נבחנות לאיתור שינויים בפנוטיפ הרלוונטי. לבסוף, שינויים בביטוי או בלוקליזציה התת-תאית של החלבון הנבדק מוצגים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שיטה זו יכולה לזהות גנים הדרושים למיקום תת-תאי תקין של חלבון המסומן בفلורסצנציה. עם זאת, ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לזהות גנים המשפיעים על פנוטיפים פוסט-עובריים אחרים שמעניינים את החוקר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים שפורסמו הוא שביצענו אופטימיזציה לעקביות ולרמה של תגובת ה-RNAi בבעלי החיים על ידי השראת ייצור של ה-RNA הדו-גדילי בחיידקים לפני הפיזור בצלחים.

את הפרוצדורה תדגים קתי פוס, עמיתה למחקר מהמעבדה שלי. בתוך חודשיים מתחילת הניסוי, הכינו את ספריית השיבוט; ראשית, בצעו ריסוס (streak) של חיידקים משבטי ספריית ההאכלה שנבחרו, וכן של בקרות חיוביות ושליליות, על מצעי LB עם tetracycline. כבקרת חיובית, השתמשו בשיבוט המכיל גן המייצר פנוטיפ פוסט-עוברי תלוי-מינון, כגון BLE four. כבקרת שלילית, השתמשו בווקטור ריק או בשיבוט המכיל פסאודוגן חזוי ללא פנוטיפים נצפים.

דגרו את הצלחות למשך לילה. עבור כל שיבט, תתחיlo את שני מיליליטר של מצע LB המכיל 50 micrograms per milliliter של חומצה קרבונית עם מושבה בודדת מלוחות הריסוס, ודגרו את התרביות למשך לילה עם ערבוב. למחרת בבוקר, התמיסות צריכות להיות עכורות. השרה את ייצור ה-RNA דו-גדילי על ידי הוספת IPTG לתרביות ודגרו אותן למשך ארבע עד חמש שעות נוספות תחת אותם תנאים.

הוספת IPTG מבטיחה השתקה (knockdown) עקבית וחזקה יותר של תוצר הגן באמצעות RNAi בהשוואה להסתמכות בלבד על ה-IPTG והמיזריקה (auger) של פלטת ה-NGM. לאחר הדגירה עם IPTG, טפטפו 30 µL תרבית מכל שיבט לתוך כל באער של פלטות NGM RNAi בנות 24 באערים שהוכשרו. שיבט אחד לכל באער. בכל פלטה יש להקצות שני באערים עבור הביקורות.

סמנו בעי carefully את מיקומו של כל ספרייה. לאחר השכפול לפלטות בעלות 24 בארות, הניחו את הפלטות ללא כיסוי בתוך מנדף סטרילי למשך כ-20 דקות לייבוש. ודאו ששולי האגר אינם נפרדים מהפלטה.

לאחר ייבוש של נמטודות בשלבים שהועברו לצלחות, ניתנות הנחיות להכנת הנמטודות. בחלק הבא, התחילו עם אוכלוסייה בשלב התפתחותי של הדרגה הזחלית הראשונה או נמטודות L1. התחלה עם זחלי L1 עוקפת פנוטיפים פוטנציאליים של מוות עוברי.

שימוש באוכלוסיית בעלי חיים בשלבים התפתחותיים מדורגים לצורך סריקה מגביר גם את הביטחון בכך שכל וריאציה שנצפתה נובעת מה-RNAi ואינה פשוט וריאציה נורמלית המתרחשת בשלבים שונים. עם זאת, אם ה-RNAi גורם לעיכוב התפתחותי, הדבר צריך להיות רשום על ידי הסורק. Bleach. אוכלוסייה בשלבים מעורבים של זן הסריקה.

רק עוברים המוגנים בקליפת ביצה ישרידו בשלב זה. השביחו את בעלי החיים לשלב של עד 12 שעות אם הפעולה מבוצעת ב-20 °C, או עד 18 שעות אם היא מבוצעת ב-16 °C, ביום שבו מוחדרים התרביות החיידקיות. בחרו שלוש צלחות של 100 מילימטר של זן סינון עם בעלי חיים בריאים, הכוללים הן בוגרים בהריון והן עוברים.

שטפו את כל בעלי החיים במצע M9 סטרילי והעבירו את תמיסת השטיפה למבחנה סטרילית של 15 מיליליטר עם מכסה הברגה. אם נפח השטיפה עולה על 3.5 מיליליטר, סובבו את בעלי החיים בצנטריפוגה והסירו את כל הנוזל למעט 3.5 מיליליטר. אם הנפח קטן מ-3.5 מיליליטר.

הגדילו את הנפח ל-3.5 milliliters באמצעות מים או M nine כדי לשחרר את העוברים מהבוגרים, תוך הוספת 1.5 milliliters של תערובת sodium hydroxide ומלבן לכל שטיפה. אפשרו לבעלי החיים להדגריר בתמיסה זו למשך לא יותר מ-10 דקות. לאחר הפעלת טיימר, ערבבו כל מבחנה במכשיר vortex למשך 10 שניות וחזרו על פעולת ה-vortex בכל שתי דקות.

לאחר כל ערבוב במכשיר vortex, בחנו את התמיסה תחת מיקרוסקופ סטריאו (dissecting scope) כדי לזהות שאריות של גופות בעלי חיים. בתוך שש עד שמונה דקות, הפרטים הבוגרים יתפרקו והעוברים אמורים להשתחרר. הסירו את העוברים מתמיסת האקונומיקה על ידי סבסוב (pelleting) והסרת מרב הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע.

לאחר מכן, השעה מחדש את המשקע בנפח של 10 milliliters על ידי הוספת M nine סטרילי תוך כדי ערבוב. חזור על תהליך שטיפה זה לפחות פעם אחת נוספת, עד שריח האקונומיקה אינו ניתן לזיהוי לחלוטין. כדי להגיע לדיוק גבוה יותר בשלב התפתחות בעלי החיים, עכב אותם בשלב L one על ידי בקיעת עוברים במצע M nine ללא מזון.

פעולה זו מבוצעת על ידי העברת העוברים במצע M nine לבקבוק ארלנמייר קטן. נעזער את הבקבוק למשך הלילה בטמפרטורה המתאימה לזן ולניסוי. במהלך זמן זה, כל בעלי החיים יבקעו וייעצרו בדיאפאוזה של שלב L1 למחרת.

חדש את צמיחת הזחלים מנקודת זמן קבועה על ידי העברתם לחיידקים המבטאים RNA דו-גדילי שהוכנו מראש. זהו אותו היום שבו בוצע הזריעה של החיידקים על פלטות ה-24 באר. התחל בהעברת בעלי חיים בשלב L1 למבחנה של 15 מיליליטר וסובב אותם במערך צנטריפוגה. לאחר מכן, רכז את בעלי החיים ל-0.5 עד 1 מיליליטר של M9 והצב 5 מיקרוליטר של נמטודות מרוכזות על פלטה.

ספרו את מספר בעלי החיים בצלחית והתאימו את תמיסת הנמטודות המרוכזת. השגיחו 30 תולעים לכל שלוש עד 10 µL. לבסוף, טפטפו כ-30 תולעים בשלב אחד על הבקטריות בכל באער של הפלטה שהוכנה.

בפלטה בעלת 24 בארות, מספר של יותר מ-30 בעלי חיים לכל בארה עלול להוביל להרעבה. לאחר שהכתמים התייבשו, תהליך שייקח מספר דקות, הדקו את המכסה באמצעות הגומייה. דגרו את בעלי החיים במצב הפוך בטמפרטורה ובמשך הזמן הנדרשים, כדי להגיע לשלב הרצוי של בעלי החיים. כאשר הנמטודות מוכנות לסריקה, ודאו שהביקורות החיוביות והשליליות מראות את הפנוטיפים הצפויים. לאחר מכן, בחנו את בעלי החיים הניסויים לאיתור חריגות התפתחותיות.

בשלב הבא, בעזרת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, העבירו שמונה עד 12 בעלי חיים מכל באר אל שקופיות Agri PET בריכוז 4% באמצעות טיפה של 5 µL של חומר הרדמה. לאחר הנחת מכסית זכוכית מתאימה, בצעו תצפיות בלפחות חמישה בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ אור. תחזקו מאגר נתונים מאורגן של הגן, מספר בעלי החיים שנצפו והתוצאות הפנוטיפיות.

עבור כל ניסוי RNAi, יש לאמת כל פנוטיפ שהתקבל באמצעות פנוטיפ משני נוסף במידת האפשר, וכן על ידי חזרה על הניסוי; בניסויים חוזרים ניתן להשתמש בחיידקים מאותו פס (streak). פסים ישנים עלולים להוביל לצמיחה דלה בתרביות נוזליות במהלך הלילה, ובמקרה כזה יש לבצע פס מחדש תחילה. חלק מהתרביות החיידקיות לא יצמחו היטב בשל תוצר הגן המובע בפלסמיד שלהן.

במקרה זה, יש להרכז פשוט את החיידקים לפני הזריעה. עבור סריקה מתמשכת, חשוב להחזיק תמיד מספר רב של עוברים מוכנים לשיוך לשלב התפתחותי. יש להזין את זן הסריקה באופן קבוע, ולא להרעיבו, ולוודא שהוא נקי ממזהמים שעשויים להשפיע על הפנוטיפ הנחקר.

קבענו לוח זמנים לתחזוקה עבור האכלת בעלי החיים. גנים המשפיעים על לוקליזציה של DBL one זוהו באמצעות RNAi תוך שימוש במערך זנים עבור סריקה זו. ביטוי נורמלי של תג GFP dbl one כולל גופי תאים של חוט העצבים הבטני, ושורה של נקודות (puncta) בבעלי חיים שהוזנו ב-RA antisense ל-DBL.

mRNA אחד הראה ביטוי מוחלש מאוד של DBL one. בעלי חיים אלו היו קטנים, בדומה לבעלי חיים חסרי DBL L one תפקודי. סריקת ה-RNA I זיהתה בהצלחה גנים רבים נוספים שמוצריהם משפיעים על מיקום ה-DBL one, ובכך הרחיבה את הבנתנו לגבי אופן ההובלה התת-תאית של TGF beta וסיפקה נקודת מוצא למחקרים רבים נוספים.

באמצעות שיטה זו, אדם אחד יכול להכין ולהבחין באופן סביר בשתי עד ארבע סדרות של ניסויים בכל שבוע. לדוגמה, בעלי חיים שהוכנו בימי שני ושלישי ניתנים למעקב בימי חמישי ושישי בהתאמה, וניתן להכין שוב בעלי חיים בימי שישי ושבת עבור ימי שני ושלישי. ביצוע תצפיות במהלך מעקב זה לאורך כל הסריקה.

חשוב להחזיק מספר רב של עוברים מוכנים לשלב הדירוג, ולכן יש לתחזק את זן הסריקה באופן קבוע. כמו כן, חשוב לרשום הערות מפורטות על כל התצפיות.