Chromosomics: איתור של שינוי המספרי מבני 24 כרומוזומים כל אדם בו זמנית באמצעות Assay רומן דגים OctoChrome
6 בפברואר 2012
הקרינה רומן באתרו ההכלאה (דגים) שיטה כי במקביל בוחנת שינויים כרומוזום הן מספריים ומבניים, בעיקר טרנסלוקציות כרומוזומליות ספציפיות הקשורות לוקמיה ולימפומה, של כל 24 הכרומוזומים האנושיים במכשיר אחד הכלאה 1, מתואר.
בדיקת ה-Octa Chrome Fish בוחנת בו-זמנית את כל 24 הכרומוזומות האנושיות בהיברידיזציה אחת על שקופית בודדת. ראשית, הכינו פריסות מטאפאזה על השקופית המרובעת הייעודית בעלת השמונה שקופיות. לאחר מכן, בצעו סריקה אוטומטית של שקופית הדגימה כדי להקל על איתור כל המטאפאזות ועל הערכה חוזרת עתידית של כל תמונות התאים.
בשלב הבא, הניחו את השקופית בעלת שמונה הריבועים מעל מכשיר ה-Octa chrome ובצעו היברידיזציה של הגששים. התוצאות המתקבלות עשויות להראות שלושה כרומוזומים שלמים צבועים באופן שונה בכל ריבוע, בהתאם לסידור שילובי הכרומוזומים במכשיר ה-RO. הרעיון לשיטת ה-RO FISH עלה לראשונה כאשר התחלתי ליישם FISH במחקרי אוכלוסיות אנושיות בתחילת שנות ה-90.
לאחר מכן הצגתי את הרעיון שלי לצביעה בשלושה צבעים, שמונה שקופיות ריבועיות להצבת התאים, בוועידה השנתית של A A CR בשנת 1994. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון כיפוף כרומוזומים קלאסי ופרוטוטייפינג ספקטרלי מודרני, הוא היכולת לנתח בקלות את כל 24 הכרומוזומים האנושיים במספר רב יותר של תאים. התחילו בהכנה של תאי מטאפאזה המקובעים בסuspended, כבקרת טיפת פיפט של תאים על שקופית, ואששו שהצפיפות הולמת.
כעת טבלו שמונה ריבועי OC כרום, והחליקו אותם לתוך אתנול טהור למשך שתי דקות. ברצף של ריבועים לסירוגין, פזרו 5 µL של תרחיף תאים על שקף התבנית כדי למנוע מהפריסות התאיות להפריע זו לזו. ייבשו את הדגימות באוויר לפני הנחת זוגות סמוכים.
החילו 20 µL של צבע DAPI בריכוז של 0.2 µg/mL למרכז כל חצי של השקופית, והניחו זכוכית כיסוי. כעת, בצעו סריקה אוטומטית של שקופית הדגימה כדי לאתר את תאי המטאפאזה. השתמשו בתוכנת metaverse כדי להקל על איתור כל המטאפאזות ועל הערכה חוזרת עתידית של כל תמונות התאים.
בחנו את תוצאות הסריקה באופן ידני ומחקו ארטיפקטים שאינם במצב מטאפאזה. ראשית, הסירו את הצביעת DPI בבופר XSSC כפול, ולאחר מכןבצעו דהידרטציה לדגימות באמצעות סדרת שטיפות אתנול. ייבשו את השקף באוויר והניחו אותו על פלטת חימום בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות.
כעת יש להביא את חיישן ה-chroma, את תא ההכלאה הרב-חיישני ואת תמיפת ההכלאה לשיווי משקל באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C, כאשר הצד המסומן פונה כלפי מטה. הניחו את מכשיר ה-OC chrome על פלטה מחממת בטמפרטורה של 37 °C. הוסיפו 2 µL של תמיסת הכלאה שחוממה מראש לכל אחד משמונה האזורים.
הפוך והכוון את התבנית בזהירות. החלק אותה מעל מכשיר ה-OC chrome. ודא שהשקופית של התבנית מיושרת למכשיר ה-Octa Chrome.
לאחר מכן, הנח בעדינות את העגלה על טיפות תמיסת ההיברידיזציה והפעיל לחץ קל ואחיד כדי לפרוס את תמיסת ההיברידיזציה עד לקצוות של כל אחד מהאזורים המוגבהים במכשיר ה-OC chrome. הרם את הקצה המטוש של העגלה והפוך אותה כך שהעגלה תהיה מתחת למכשיר ה-OC chrome. הנח על פלטה חימום בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות.
לאחר מכן, העבירו את הדגימה לפלטה מחוממת בטמפרטורה של 75 °C למשך חמש דקות. כדי לדנטור ל-דגימות עבור שלב ההיברידיזציה, העבירו אותן לתא היברידיזציה של chroma probe, multi probe. החזירו את המכסה והניחו את התא לצוף במסבך מים בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה.
הוצאו את השקופית בזהירות מהמכשיר ושטפו ב-0.4 excess SC בטמפרטורה של 72 °C למשך שתי דקות. בצעו את השטיפה השנייה בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. המשיכו להוסיף 20 µL של DPI למרכז כל חצי של השקופית והניחו זכוכית כיסוי.
יש להדגיר את הדגימות בחושך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני הבחינה במיקרוסקופ פלואורסצנציה. בדיקת Octa chrome fish מאפשרת בחינה בו-זמנית של כל 24 הכרומוזומים האנושיים באמצעות היברידיזציה אחת על שקופית אחת. כל ריבוע כולל שלושה גששים שונים לצביעת כרומוזומים שלמים, המסומנים ישירות בפלואורופורים בצבעים שונים.
בדיקה של תא מטאפאזה נורמלי בריבוע שתיים של מערכת ה-Octa CHRO מראה כי כרומוזומים 8, 21 ו-12 צבועים באדום, ירוק וכחול. ניתן להדמות אותם באופן 개별י באמצעות המסננים המתאימים, או להדמותם בו-זמנית באמצעות מסנן משולב של DAPI, Fitzy ו-Texas Red. גישה זו לכרומוזומים שימושית לזיהוי תאים חריגים עם טרנסלוקציות כרומוזומליות ואנויפלואידיה הספציפיים לליקומיה.
לדוגמה, T 8 21 היא טרנסלוקציה כרומוזומלית נפוצה בלוקמיה מיאלואידית חריפה. טריסומיה 21, הכוללת 3 עותקים של כרומוזום 21, היא אנאפלואידיה נפוצה בלוקמיה לאחר הפיתוח. טכניקה זו סללה את הדרך עבור מדענים בתחומי הציטוגנטיקה המולקולרית והאפידמיולוגיה המולקולרית לחקור את הסידורים הכרומוזומליים הנפוצים ביותר המגולים בלוקמיה ובלימפומה, ולבחון פלואידיות סלקטיבית בקרב כל הכרומוזומים האנושיים בחולים קליניים או באוכלוסיות שנחשפו לחומרים רעילים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של אופן הבדיקה הסימולטנית של כל 24 הכרומוזומות האנושיות בהיברידיזציה אחת על שקופית אחת באמצעות בדיקת Octo Chrome Fish. ואנו מגדירים זאת ככרומוזומות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה חדשה להיברידיזציה פלואורסצנטית באתר (FISH) הידועה כבדיקת Octa Chrome Fish. שיטה זו מאפשרת בדיקה סימולטנית של כל 24 הכרומוזומים האנושיים בהיברידיזציה אחת על שקופית אחת, תוך התמקדות בשינויים כרומוזומליים הקשורים ללוקמיה ולימפומה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (FISH)
- ניתוח כרומוזומלי
- אונקולוגיה
רקע
- FISH היא טכניקה המשמשת לזיהוי ואיתור של נוכחות או היעדר של רצפי DNA ספציפיים על כרומוזומים.
- טרנסלוקציות כרומוזומליות הן בעלות חשיבות רבה בחקר לוקמיה ולימפומה.
- השיטה מאפשרת ניתוח מקיף של שינויים כרומוזומליים.
- שיטות קודמות דהרו מספר היברידיזציות, מה שהופך גישה זו ליעילה יותר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה המפשטת את הגילוי של חריגות כרומוזומליות.
- שיפור היעילות של ניתוח כרומוזומלי במסגרות קליניות.
- אספקת כלי להבנה טובה יותר של הבסיס הגנטי של ממאירות המטולוגיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת פריסות מטאפאזה על סלייד ייעודי בעל שמונה ריבועים.
- סריקה אוטומטית של הסלייד לאיתור מטאפאזות לצורך ניתוח.
- היברידיזציה של גששים באמצעות מכשיר ה-Octa Chrome.
- ויזואליזציה של התוצאות המציגה כרומוזומים שלמים בצבעים שונים בהתבסס על הסידורים.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מאפשרת ויזואליזציה מוצלחת של כל 24 הכרומוזומים בהכלאה בודדת.
- התוצאות יכולות להציג שלושה כרומוזומים צבועים שונים בכל ריבוע של הפסחית.
- השיטה מקלה על הערכה מחדש של תמונות תאים לצורך ניתוח מקיף.
- התהליך מדגים פוטנציאל ליישום במחקרי אוכלוסיות אנושיות.
מסקנות
- בדיקת ה-Octa Chrome Fish מהווה התקדמות משמעותית במתודולוגיית ה-FISH.
- שיטה זו יכולה לשפר את הזיהוי של הפרעות כרומוזומליות בסרטני דם.
- היא מציעה גישה יעילה יותר עבור חוקרים וקלינאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת OctoChrome-FISH מאפשרת זיהוי סימולטני של שינויים כרומוזומליים מספריים ומבניים בכל 24 הכרומוזומים האנושיים בהיברידיזציה אחת, ובכך פותרת צוואר בקבוק מרכזי בניתוח ציטוגנטי של ממאירות המטולוגיות. באמצעות איחוד של סריקת גנום שלם למסלול עבודה יחיד המבוסס על זכוכית, היא משפרת את התפוקה ואת ההדירות במחקר של לוקמיה ולימפומה, ותומכת באימות מוקדם של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלב הגילוי הפרה-קליני. יכולת זו משפרת את הביטחון החזוי בזיהוי אונקוגנים המונעים על ידי טרנסלוקציה ודפוסי אנאופלואידיות הרלוונטיים ללוקמוגנזה המושרית על ידי בנזן וחשיפות לרעלים אחרים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של טרנסלוקציות ספציפיות ללוקמיה, כגון t(9;22), t(15;17), t(8;21) ו-t(14;18), בהקשר הכרומוזומלי הטבעי שלהן.
- ערך תפעולי: מפחית את הצורך במספר היברידיזציות FISH רצופות, ובכך חוסך בדגימות ומאיץ את אישור המטרה בביולוגיה של גילוי.
- ערך חיזוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי מתן הערכה סימולטנית של ארגון מחדש מבני ואנויפלואידיה ברחבי הגנום, ובכך משפר את רמת הוודאות לגבי קשרי מטרה-מחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: הכנת מערכות כרומוזומליות שעברו תיקוף לצורך סריקה בהמשך, באמצעות קביעת קריוטיפים בסיסיים וזיהוי שיעורי שינויים ברקע באוכלוסיות שנחשפו.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תוצרי ציטוגנטיקה באמצעות סימון עקבי של גששים ומבנה שקופיות, מה שמשפר את השחזוריות בין מעבדות ובמסעות סריקה.
- ערך סקילביליות: מאפשר ניתוח עתיר-תוכן של פריסות מטאפאזה באמצעות סריקה אוטומטית, מה שמקל על הערכה מחדש ומעקב אורך של יציבות כרומוזומלית במחקרי רעילות ארוכי טווח.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לאימות פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה של שינויים כרומוזומליים במודלים של תאים, דגימות מטופלים וקוהורטות של אוכלוסיות שנחשפו לחומרים מסרטנים הגורמים ללוקמיה (leukemogens) כגון benzene.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהיר האם האנאופלואידיות או התעתיקים (translocations) שנצפו הם אירועים אקראיים או דפוסים הקשורים לחשיפה, ובכך מסייע בהערכת סיכונים בפיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- ערך רציפות: תומך במעבר חלק מממצאים in vitro לרלוונטיות in vivo על ידי שמירה על רזולוציה כרומוזומלית עקבית בין מערכות מודל לדגימות אנושיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline & Workflow Integration)
הבדיקה משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשרת ניתוח כרומוזומלי בשלבים מוקדמים של בדיקת השערות, תוך תמיכה בזיהוי מועמדים מובילים באמצעות הפחתת סיכונים מכניסטיים של אי-יציבות גנומית.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת השערות לגבי מנגנונים כרומוזומליים בתהליך הלוקמוגנזה, על ידי מתן אפשרות לסריקה סימולטנית של שינויים מרובים, ידועים וחדשים, ברחבי הגנום.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים ומרובי-סמנים (multiplexed) (למשל, תדירות טרנסלוקציה, שיעורי אנאופלואידיות) המאפשרים השוואה של השפעות תרכובות או חשיפות בין תנאים שונים.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות פלואורסצנציה מרובות-סמנים התואמות לדימות אוטומטי ולקריוטיפינג בסיוע תוכנה, מה שמאפשר השוואה אובייקטיבית של מצבים כרומוזומליים.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאים in vitro לרלוונטיות אנושית על ידי זיהוי דפוסים כרומוזומליים זהים במחקרי אוכלוסיות, ובכך תומכת בהתאמה של ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה ציטוגנטית רב-פעמית שניתן ליישם בתוכניות של אונקולוגיה, רעילות ותרופות-גנומיקה הדורשות הערכה של שלמות כרומוזומלית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת תוצאות שגויות שליליות באמצעות כיסוי כרומוזומלי מקיף.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות מערכי גששים ופורמט שקופיות סטנדרטיים, ובכך ממזער את השונות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת צריכת ריאגנטים וזמן עבודה מעשית בהשוואה לגישות FISH או SKY סדרתיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות על קידום מועמדים מובילים בהתאם לסיכון, על ידי אספקת ראיות מוקדמות ליציבות או חוסר יציבות גנומית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובהכנה ציטוגנטית ליצירה מדויקת של פריסות מטאפזה ולפירוש האותות.
- תלוי בגישה למכשיר ה-OctoChrome ולתאי היברידיזציה תואמים להחדרה סימולטנית של מספר גששים.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הטיפול בلامשטחים, הדנטורציה והשטיפה כדי להבטיח חדירה עקבית של הגששים ויחסי אות לרעש אחידים.
- התאמה למערכות מודל שאינן אנושיות עשויה לדרוש תיקוף מחדש של ספציפיות הגשש ויעילות הצביעה הכרומוזומלית.
- מגבלות מעשיות כוללות הסתמכות על דגימות באיכות מטאפזה וסבירות לחפיפת אותות בגנומים עם ארגון מחדש רב, דבר המצריך הפרדה ספקטרלית (spectral unmixing) קפדנית.
