זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases
26 בדצמבר 2011
שימוש glycosidases ספציפי להסיר סוכרים מן גליקופרוטאינים ואחריו SDS-PAGE היא שיטה ערך כדי לזהות שינויים glycan על דגימות חלבון היא בחירה טובה עבור מחקרים glycobiology הראשונית. השינויים הבאים deglycosylation ניתן לאתר כמו משמרות ניידות ג'ל או מכתים עם ריאגנטים רגיש glycan.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדגים את השימוש ב-glycosate לצורך דגליקוזילציה אנזימטית ואנליזה של גליקוזילציה מסוג n ו-O בחלבון גליקוזילי מודלי. זאת מושג על ידי טיפול בחלבון גליקוזילי באמצעות PGA's F או באמצעות תערובת לדגליקוזילציה של חלבונים. בנוסף, תערובת הדגליקוזילציה של חלבונים הועשרה בתערובת של exo glyco ass נוספים, המסייעים לעיתים בהסרה של סוכרים העמידים בדרך כלל.
אנו מדגימים שיטה זו באמצעות גליקופרוטאין מודל, הורמון גונדוטרופין כוריוני אנושי רקומביננטי בטא, או HCG beta, באמצעות SDS page, ולאחר מכן צביעה ב-Kumasi blue ושיטת צביעה ספציפית לסוכר. Pro Q Emerald 300 משמשים לצורך ניתוח הגליקוזילציה. התוצאות שהתקבלו מדגימות HCG beta מראות כי HCG beta עובר גליקוזילציה הטרוגנית ומכיל מספר גליקו-צורות, בהתבסס על ההבדלים בניוד הפרוטאין עם ובלי טיפול בגליקוזידאז ועל האות המוחלש בצביעת ProQ ככל שהגליקנים מוסרים באופן רציף.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אנליזה באמצעות ספקטרומטריית מסות, הוא פשטותה, השימוש בציוד מעבדה נפוץ והתאמתה עבור ביולוגים של גליקנים מתחילים. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום הגליקו-ביולוגיה, כגון האם החלבון שלי עבר גליקוזילציה. כדי להתחיל בדגליקוזילציה אנזימטית, הפשיר את הבאפרים המסופקים מהערכה לדגליקוזילציה של חלבונים.
ערבבו את המבחנות ביסודיות ושמרו אותן בטמפרטורת החדר. הניחו את מבחנות האנזים על קרח, המיסו את תכולת מבחנת ה-HCG beta ב-600 microliters של מים מזוקקים ושמרו על קרח. לאחר הכנת מיליליטר אחד של בופר one XG seven על ידי דילול של מלאי ה-10 x במים מזוקקים, השתמשו ב-25 microliters כדי לדלל 0.5 microliters של PGA's f.
הכינו את תערובת ה-exo glycosate על ידי שילוב של שני מיקרוליטרים מכל אחד מארבעת ה-exo glyco diseases. לאחר מכן, הוסיפו HCG beta ו-10 x glycoprotein denaturing buffer לשבעה מבחנות PCR ממוספרות כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב, סגרו את המבחנות וערבבו בעדינות. דנאטורו את החלבונים בתרמוסייקלר על ידי דגירה במשך 10 דקות ב-94 °C, ולאחר מכן השהייה ב-4 °C. לאחר הוצאת המבחנות מהתרמוסייקלר, סובבו אותן בצנטריפוגה כדי להסיר עיבוי נראה לעין. לכל מבחנת תגובה, הוסיפו את שאר הריאגנטים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. סגרו את מבחנות ה-PCR באמצעות פקקים חדשים.
לאחר מכן, ערבבו את המבחנות על ידי הנקשה עדינה ארבע פעמים לאחר ספינט-דאון (spinning down) של התוכן, הניחו את המבחנות בטרמוסייקלר והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות. לאחר מכן, קררו את הדגימות ל-4 °C. להכנת SDS page, הכינו תמיסת טעינה (loading buffer) של SDS מחזרת בריכוז 3x טרייה.
הוסיפו 12.5 µL של באפר טעינה SDS מחזר ריכוז 3x שהוכן עם DTT לכל דגימה, סגרו את המבחנות עם פקקים חדשים והקישו עליהן בעדינות כדי לערבב. דגרו את המבחנות בטרמוסייקלר בטמפרטורה של 94 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן קררו ל-4 °C. לאחר הדגירה, טענו 30 µL מכל דגימה ו-10 µL של סמן חלבון על ג'ל tri glycine בריכוז 10% עד 20%. שמרו את שאר תכולת כל דגימה.
בצע אלקטרופורזה לג'ל במתח של 130 volts עד שחזית ה-D תגיע לקרוב לתחתית הג'ל. בסיום ההרצה, הוצא את הג'ל מהתבנית והנח אותו בקופסת פלסטיק קטנה עם כמות מספקת של צבע kumasi blue שתכסה את הג'ל. צבע את הג'ל למשך שעה אחת תוך כדי ערבוב עדין לאחר שביצעו את צביעת הג'ל.
שטפו שלוש פעמים למשך 30 דקות. ב-50 מיליליטר של תמיסת detain, רשמו את התמונות באמצעות transluminator לאור לבן או סורק. לחלופין, ניתן לייבש את הג'ל בין דפי צלופן.
במסגרת הניסוי, הרץ את השאריות מכל דגימה ואת סמן חלבון על ג'ל Tri glycine בריכוז של 10% עד 20% בזמן שהג'ל רץ. המסס את ריאגנט ProQ emerald באמצעות DMF והכן את תמיסות המלאי לקיבוע, לשטיפה ולהחמצן עבור הצביעה בהתאם למדריך המוצר המצורף לערכה. עם סיום האלקטרופורזה, הוצא את הג'ל מהתבנית והנח אותו בתוך קופסה מפלסטיק.
קבע את הג'ל על ידי הוספת 100 milliliters של תמיסת הקיבוע שהוכנה. השאר את הג'ל למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין למחרת. שטוף את הג'ל עם 100 milliliters של תמיסת השטיפה שהוכנה למשך 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין, וחזור על השטיפה פעם שנייה עם תמיסת שטיפה רעננה.
בשלב הבא, חמצנו את הפחמימות על ידי דגירה של הג'ל עם ניעור עדין למשך 30 דקות ב-25 milliliters של תמיסת החמצון שהוכנה, ולאחר הדגירה בצעו שני שטיפות נוספות בזמן שטיפת הג'ל. הכינו צביעה טרייה של ProQ emerald 300 על ידי הוספת 500 microliters של תמיסת הריאגנט ProQ Emerald 300 ל-25 milliliters של בופר צביעה המסופק בערכה. צבעו את הג'ל על ידי דגירה בצבע שהוכן בתנאי חוש עם ניעור עדין למשך 90 עד 120 דקות לאחר צביעת הג'ל.
חזור על שני שלבי השטיפה כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, רשום את התמונות באמצעות מאיר חוזר (trans illuminator) UV ב-300 nanometers. כשלב סופי, השווה בין התמונות של הג'ל שצבע ב-kumasi לבין הג'ל שצבע ב-ProQ emerald.
ניתן לראות את השינויים בנדידת החלבון לאחר דגליקוזילציה אנזימטית כאשר משווים את דגימת הביקורת לטיפול F של ה-PGA. להסרת n-glycans וטיפול בתערובת דגליקוזילציה להסרת n- ו-O-glycans, לא נצפה צמצום נוסף בגודל לאחר עיכול עם glycosate נוסף. מלבד שינוי במסה, הפסים הופכים חדים יותר ככל שהגליקנים מוסרים.
פס שנמצא מתחת לסמן של 17 kilodalton מייצג ככל הנראה את הפוליפפטיד HCG beta לאחר הסרה מלאה של הגליקוזילציה. נתיבים חמישה עד שבעה מראים את הפסים המתאימים ל-Glyco. פסים אחרים עשויים לנבוע מגליקוזילציה חלקית או מחלבונים לא מזוהים מרובים הנוכחים בדגימת ה-HCG beta.
ריאגנט הירוק הزمרדי (emerald green) מחמצן וצובע את כל הגליקנים הנמצאים במולקולת חלבון. לכן, עוצמת האות פוחתת ככל ש-HCG beta עובר ד-גליקוזילציה אנזימטית. האות השארי בנתיבים שלושה וארבע מעיד על נוכחות של מוטיבים של גליקנים, העמידים לאנזימים שנעשה בהם שימוש.
הגליקוזאט הנוסף משמש בנתיב ארבע. הסר מספר שאריות סוכר נוספות. נדידת החלבון היא זהה, אך ניתן להבחין בהפחתה קלה בעוצמת הצביעה.
שאריות סוכר עמידות לא היו נוכחות בכל מיני החלבונים. חלק מהפסים לא זוהו על ידי emerald Green, מה שמעיד על כך שהם עברו דה-גליקוזילציה נרחבת. נתונים נוספים תומכים במסקנה ש-HCG beta הוא בעל גליקוזילציה הטרוגנית. הפס התחתון בנתיב שתיים הוא חלש בתמונת ה-emerald green.
בעוד שהפס העליון בנתיב שתיים הוא בהיר, מה שמעיד על כך שקבוצות GLYCAN רבות עדיין נוכחות, נתונים אלו תומכים במסקנה ש-HCG beta רקומביננטי המבוטא בתאי עכבר מכיל צורות גליקו-מרובות בשל ההטרוגניות האינהרנטית של הגליקוזילציה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ספקטרומטריית מסה כדי לענות על שאלות נוספות כגון, מהו שיעור התפוסה? מהו היקף הגליקוזילציה, או מהו המבנה העדין של הגליקנים?
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש ב-glycosylate לצורך דגליקוזילציה אנזימטית ואנליזה של NNO Linked Glycans על גליקופרוטאינים. בחירת שיטת הדטקציה עלולה להיות מאתגרת, כיוון שצביעת חלבונים יעילה רק אם הדגליקוזילציה גורמת להסטה משמעותית במסה המולקולרית של חלבונים אחרים.
ראינו הגירות לא תקינות לאחר הסרת הגליקוזילציה (deglycosylation) ומצאנו שכל שינוי בהגירה מהווה עדות לכך שהחלבון עבר הסרת גליקוזילציה.
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את השימוש בגליקוסידזים עבור דגליקוזיליזציה אנזימטית של גליקופרוטאינים, עם התמקדות ב-human chorionic gonadotropin beta (HCG beta) רקומביננטי. השיטה מאפשרת ניתוח של גליקוזיליזציה מסוג N ו-O באמצעות SDS-PAGE וטכניקות צביעה ספציפיות.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- גליקוביולוגיה
- ניתוח חלבונים
- ביוכימיה
רקע
- גליקוזילציה היא מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונית קריטית המשפיעה על תפקוד חלבונים.
- טכניקות דגליקוזילציה הן חיוניות לחקר מודיפיקציות של גליקנים.
- SDS-PAGE היא שיטה נפוצה לניתוח ניידות חלבונים.
- שיטות צביעה ספציפיות יכולות להדגיש את נוכחותם של גליקנים.
מטרת המחקר
- להדגים את תהליך הדגליקוזילציה האנזימטית באמצעות גליקוזידזות.
- לנתח מודיפיקציות של גליקנים בחלבון גליקוזילציה מודלי.
- לספק שיטה פשוטה עבור חוקרים מתחילים בתחום הגליקביולוגיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טיפול אנזימטי של HCG beta באמצעות גליקוסידאזות ספציפיות.
- SDS-PAGE להפרדת חלבונים על בסיס משקל מולקולרי.
- צביעת Kumasi blue להדמיה כללית של חלבונים.
- צביעת ProQ Emerald 300 לזיהוי ספציפי של גליקנים.
תוצאות עיקריות
- HCG beta הפגין דפוסי גליקוזילציה הטרוגניים.
- נצפו שינויים בניוד של החלבון לאחר הסרת הגליקנים (deglycosylation).
- עוצמת האות פחתה עם הסרת הגליקנים.
- השוואה בין הגלים הצבועים חשפה הבדלים בנוכחות הגליקנים.
מסקנות
- השיטה יעילה לניתוח מודיפיקציות של גליקנים על חלבונים.
- היא מספקת חלופה פשוטה לטכניקות מורכבות יותר, כגון ספקטרומטריה של מסות.
- התוצאות עשויות לסייע במתן תשובה לשאלות יסודיות בביולוגיה של גליקנים (גליקוביולוגיה).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דה-גליקוזילציה אנזימטית באמצעות גליקוזידזות מספקת שיטה מהירה ונגישה להערכת ההטרוגניות של גליקופרוטאינים, התומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים על ידי הבהרת מצב המודיפיקציות לאחר תרגום. גישה זו מאפשרת לצוותי מו"פ בביו-פארמה להעריך השפעות המתווכות על ידי גליקנים על יציבות חלבונים, תעתוע ותפקוד, ללא צורך במכשור ייעודי. השיטה תומכת בהורדת סיכונים מכניסטית בתהליכי גילוי על ידי קישור דפוסי גליקנים לתוצאות תפקודיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרות
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של הטרוגניות הגליקוזילציה כדי להעריך את השפעתה על תפקוד החלבון ועל קישור למטרה.
- ערך תפעולי: משתמש בציוד ובריאגנטים סטנדרטיים של מעבדה, מה שמאפשר סריקה מהירה של וריאנטים של גליקופרוטאין.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: יצירת צורות חלבון עם גליקנים מקוצרים לשימוש במבחנים סטנדרטיים הדורשים גליקופורמים מוגדרים.
- ערך תפעולי: הפקת תכשירי חלבון עקביים וניתנים לשחזור המתאימים לפורמטים של סריקה בספיקו גבוה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בניתוח של איזופורמים של גליקופרוטאינים רלוונטיים למחלות על ידי הפרדה של מיקרו-הטרוגניות המתווכת על ידי גליקנים.
- ערך תפעולי: מקל על השוואה בין מנות של גליקופרוטאינים רקומביננטיים כדי להבטיח עקביות במחקרים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי המולקולה המובילה (lead identification), כאשר אפיון הגליקופרוטאין מספק מידע על קשרי מבנה-תפקוד והערכות של יכולת פיתוח (developability).
- ביולוגיה של הגילוי: מבהירה את תפקידם של גליקנים מקושרי N ו-O בקיפול חלבונים, ביציבות ובפעילות תאית.
- סריקה: מאפשרת הכנה של בקרות ללא גליקנים (deglycosylated) עבור בדיקות אנזימטיות או קישור תלוי גליקן.
- אנליטיקה: מספקת קריאות איכותניות וחצי-כמותיות באמצעות הזזות (shifts) בגל ועוצמת צביעה ספציפית לגליקנים.
- מחקר תרגומי: מסייעת להתאמה של פרופילי גליקופרוטאין רקומביננטיים עם איזופורמים טבעיים שנצפו בדגימות קליניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצגת יכולת מודולרית וניתנת להרחבה, הישימה על יעדי גליקופרוטאין מרובים בפורטפוליו.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד תרומת הגליקנים להתנהגות החלבון.
- ערך תפעולי: דורש רק אינקובטורים סטנדרטיים, צנטריפוגות ומערכות אלקטרופורזה של ג'ל.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי חשיפת סיכונים הקשורים לגליקנים ביחס ליכולת הייצור ולפרמטריקה של התרופה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של מועמדים גליקופרוטאיניים על בסיס הניתנות לטיפול בגליקוזילציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בגליקופרוטאינים ובאופטימיזציה של תגובות אנזימטיות.
- תלוי בגישה לאנזימי גליקוסידאז ספציפיים (למשל, PNGase F, O-Glycosidase, תערובות exoglycosidase).
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי דנטורציה, אינקובציה וצביעה בין צוותים שונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מבני גליקאן לא סטנדרטיים או מערכות ביטוי אתיפיות של גליקופרוטאינים.
- מוגבל לאנליזה איכותית או חצי-כמותית; נדרשות שיטות משלימות (למשל, מספקטרומטריה) עבור ריצוף מפורט של גליקנים.
