הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להקנות לחיידקים תכונות היצמדות כדי להקל על הפרדתם ממצעים נוזליים. דבר זה מושג תחילה על ידי תכנון curli סינתטי כדי לעקוף רגולציה גנטית מורכבת ולאפשר ייצור קל ומסיבי של פולימרים דביקים. בשלב השני, חיידקים נצמדים עוברים ויזואליזציה וכימות על פוליסטירן, דבר המאפשר הערכה מהירה של יעילות המכשיר הסינתטי.

בשלב הבא, חיידקים נצמדים מאושרים על זכוכית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. כדי לצפות ישירות בביופילם ולהשיג מידע על מבנהו, התקבלו תוצאות המראות עלייה משמעותית בהצמדה בזן הנושא את המכשיר הסינתטי, הן על סמך מדידת אחוזי ההצמדה והן על סמך תצפיות מיקרוסקופיות. היתרון המרכזי של גישת הביולוגיה הסינתטית על פני שיטות קיימות, כגון שיクלונינג קונבנציונלי, הוא שניתן להשיג במהירות רבה קונסטרוקט המכיל אך ורק את הגנים הנדרשים באופן מובהק עם אותות מתאימים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלה מרכזית בתחום הביורמדיאציה (bioremediation), כגון התמודדות עם האתגר של הסרת חיידקים טעוני מתכות מפסולת רדיואקטיבית. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להיתקל בקשיים, שכן היא דורשת ידע בסיסי באותות ויסות גנטיים ובניהול מאגרי נתונים. הדגמה חזותית תתמקד בכימות ובויזואליזציה של ביופילם, שכן שני שלבים אלו קשים מאוד ללמידה בשל השבריריות של מסגרות הביו (bioframes).

השלב הראשון בתכנון ה-carron הסינתטי הוא קביעת הארגון הגנטי של הגנים האחראים על הקירוב (curly genes) ואיתור האותים האנדוגניים, התעתוקיים והתרגומיים שלהם. פעולה זו מבוצעת באמצעות מאגרי מידע ייעודיים כגון REON DB או eco gene. השלב הבא הוא בחירת חמשת הגנים הדרושים באופן מוחלט לסינתזת הקירוב: CSGB ו-CSGA המקודדים למonomers של הסיבים, ו-C-S-G-E, C-S-G-F ו-CSGG המקודדים לקומפלקס הפרשת הקירוב. את הרצפים הנבחרים יוציאו מהמאגר בפורמט fasta; ניהול נתונים וניתוח מקדמי in silico יבוצעו באמצעות תוכנת clone manager, מכיוון שצביר ה-C-S-G-G-F-E הוא antisense בגנום של e coli.

יש להמיר רצף זה למשלב המשלב המשלים ההפוך שלו. השתמש בפעולות של כלי מנהל השבטים (clone manager tools) כדי להפוך את המולקולה (invert molecule), והדבק את הרצף C-S-G-E-F-G אחרי C-S-G-B-A באמצעות פונקציית הליגציה (ligate). לאחר מכן, הוסף את הפרומוטור המתאים PRCN לפני רצף ה-iCal מסוג C-S-G-B-A-E-F-G.

הלוקוס RCN מקודד למשאבת FLX מסוג RCNA, האחראית לניקוי רעלים של ניקל וקובלט, ולמתכת הרגולטורית התואמה לו RCNR. בהיעדר קובלט או ניקל, הרססור RCNR נקשר לתיבת RCNR על ה-DNA ומונע את הפעלת השעתוק המלאה של הגנים שבאחריו. אם הריכוז התוך-תאי של קובלט או ניקל עולה, קישור של קובלט או ניקל לחלבון RCNR מונע את קיבוע הרססור למקדם, והפעילות השעתוקית של P-R-C-N-A עולה על ידי הבאת חמשת הגנים המסולסלים שנבחרו תחת בקרתו של המקדם.

צפוי כי PRCN curly ייוצרו ביתר על ידי נוכחות של קובלט וניקל. לאחר מכן, יש לייעל את אותות השכיריות על ידי הוספה של אתר קישור לריבוזום (RBS) מושלם לפני רצף ה-ATG הראשון של רצף ה-DNA של CS gba, ו-RBS מושלם שני לפני רצף C-S-G-E-F-G. כדי לעמוד בתקני iGMs, על ההתקן להיות מוקף בקידומת bio brick סטנדרטית המכילה אתרי הגבלה עבור ECO R one ו-X-bar one, ובסיומת המכילה אתרי הגבלה עבור SPE one ו-PST one כדי להקל על ההרכבה בהמשך.

ייתכן שחלק ה-bio brick עצמו לא יכיל אתרי זיהוי של ECO R one, PST one SPE one, ו-X-bar R one. לפיכך, אתרים אלו הוסרו באמצעות שינויים של מוטציות שקטות; ניתוח הגבלה in silico של המכשיר חשף אתר PST one אחד ברצף ה-CSGA, אתר PST one אחד ברצף ה-RCNR ואתר ECO R one אחד בגן ה-CSGE. אתרים אלו שונו באמצעות מוטציות שקטות.

לאחר השלמת תכנון האופרון הסינתטי, הריצו סימולציית תרגום באמצעות תוכנת ניהול השבטים (clone manager). השתמשו בתוכנת היישור רצפים blast כדי לוודא הומוגניה מושלמת בין חלבוני ה-curly מסוג הבר (wild type) לבין החלבונים המקודדים על ידי האופרון הסינתטי. כדי להתחיל את הפרוצדורה, מלאו כל באר בלוח פוליסטירן בעל 24 בארות בשני מיליליטר של M 63, מצע מינימלי עם 0.2% glucose. זרקו לכל באר 10⁶ תאים מתרבית חיידקים שהגדלה למשך לילה. גדלו את החיידקים בטמפרטורה של 30 °C למשך 18 עד 48 שעות ללא ניעור. כל עמודה בלוח בעל 24 הבארים מייצגת מודאליות אחת.

כמות נכונה של קובלט ואנטיביוטיקה מתווספת בעת הצורך. שלוש השורות הראשונות משמשות לכימות החיידקים הדבקים על ידי חישוב ממוצע של שלושת החזרות. השורה האחרונה משמאל משמשת להדמיות של הביופילם באמצעות צביעה בקריסטל ויולט לאחר 18 עד 48 שעות; יש לאסוף את הנוזל העליון המכיל את התאים הפלנקטוניים מכל באר משלוש השורות הראשונות של פלטת 24 הבארים ולהעביר את הנוזל העליון למבחנה להמוליזה.

שטפו בזהירות כל באר עם מיליליטר אחד של מצע M 63 ושאבו את תמיסת השטיפה אל מבחנה המוליזה עם הסופינאט הראשוני. מאגר זה מכונה תאי שחייה ומסומן כ-S. תחתית הבארים במיקרופלטה מכוסה בתאים נצמדים. כדי להשיג את הביופילם, הוסיפו מיליליטר אחד של M 63 לכל באר.

גרדו את הדגימה באמצעות קצה הפפטה, ולאחר מכן בצעו פיפטינג (שאיבה ושחרור) למעלה ולמטה והעבירו את חלק הביופילם למבחנת המוליזה חדשה. ערבלו את המבחנה ב-Vortex למשך 15 שניות. אספו את חלק הביופילם במבחנות המוליזה.

מאגר זה מייצג את התאים ההודבקים לפני השטח בשם B. העבירו 200 µL של סופרנאט ושל פראקציית הביופילם מנבובות ההמוליזה לפלטה בעלת 96 בארות. העריכו את מספר החיידקים ההודבקים לפני השטח ואת החיידקים השוחים על סמך הצפיפות האופטית ב-600 nm. אחוז ההיצמדות עבור כל מודאליות מחושב באמצעות הנוסחה B כפול 100 חלקי 3 פעמים S פלוס B. כדי להמחיש את הביופילם עבור השורה האחרונה בלבד של הפלטה בעלת 24 הבארות, השליכו את תאי הפלנקטון מאותן בארות.

הוסיפו מיליליטר אחד של M 63 לכל באער כדי לשטוף את הביופילם שהתפתח בתחתית הפלטה. ייבשו את הפלטה הפתוחה למשך שעה אחת ב-80 °C; לאחר שעה, הוסיפו לכל באער 100 µL של 20% crystal violet למשך שתי דקות, ולאחר מכן בצעו שטיפות נרחבות במים. פרוטוקול זה דורש chassis פלואורסצנטי.

מארח מתאים לפלסמיד הנושא את ה-curly הסינתטי הוא זן e coli SCC one, המבטא באופן קבוע חלבון פלואורסצנטי ירוק ללא הבדל ניכר מזן האב MG 1 16 55. בצע טרנספורמציה לזן המארח עם פלסמיד puck 57 הנושא את ה-curli הסינתטי כדי לקבל את זן S 23. בצע טרנספורמציה לזן המארח עם פלסמיד בקרה puck 18 כדי לקבל את זן הבקרה.

גדלו במהלך הלילה תרביות מקדימות של זני S 23 ו-S 24 בטמפרטורה של 30 °C, במצע M 63 מועשר בגלוקוז ובאמפיצילין. למחרת, הוסיפו 20 מיליליטר של מצע M 63 לצלח פטרי, ולאחר מכן חסנו 15 מיליליטר של M 63 בצלחונות פטרי עם 100 µL מהתרביות המקדימות. הוסיפו את ריכוז הקובלט המתאים ואל תשכחו את הביקורת השלילית ללא קובלט.

הכניסו שלוש זכוכית כיסוי מלבניות לכל צלחת פטרי. דגרו את הצלחות למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C ללא ניעור. ניתן יהיה להוות את החיידקים ישירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בימים הבאים.

חשוב למנוע ייבוש של הדגימה, לכן יש לבצע את השלבים הבאים בזהירות אך במהירות. הסירו כל כיסוי זכוכית (cover slip) מתוך צלח Petri ורוקנו אותו בזהירות. נקו בזהירות את הפנים התחתון באמצעות מקלון צמר השרויה ב-70% ethanol כדי להסיר את כל שאריות החיידקים לצורך תצפית במיקרוסקופ קונפוקאלי.

הניחו את כיסוי הזריקה על גבי שקופית זכוכית, כאשר הפנים העליון המכוסה בביופילם פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, כסו את הביופילם בכיסוי זריקה גדול יותר, וקבעו אותו לשקופית באמצעות לכה.

הפוך את המערך כך שהביופילם יהיה כעת בצד התחתון. הנח את המערך תחת המיקרוסקופ הלייזר קונפוקאלי בניסוי זה. במיקרוסקופ לייזר קונפוקאלי Zeiss LSM five 10 meta נעשה שימוש בתוך פלטפורמת ה-CT micro.

בחרו בעדשה עם הגדלה של 40x עם טבילה בשמן. השתמשו בהגדרות הבאות: עבדו עם עירור של GFP באורך גל של 488 nanometers ואספו את הפלואורסצנציה החיידקית בטווח של 500 עד 600 nanometers. השתמשו בעדשה עם הגדלה של 40x עם טבילה בשמן לצורך רכישת התמונות.

במצב סריקה קונפוקלית בלייזר, סרקו את המבנים התלת-ממדיים הכלליים של הביופילמים מהמשטח המוצק ועד לממשק עם מצע הגידול, תוך שימוש בצעד של one micron.

בצעו הקרנות בתלת-ממד באמצעות תוכנת maus, וקבעו את עובי הביופילם על ידי ניתוח ערך C הממוצע לאורך חתכים אורך סטטיסטיים. ניתן להוציא את הכמותיות של הביופילם ונפחי הביו (bio volumes) מתוך ערימות Z (Z stacks) קונפוקאליות. ניתן להעריך את יכולות ההיצמדות של e coli שהונדסה לייצר כמות מוגברת של curly בתגובה למתכת באמצעות שיטות פשוטות.

לדוגמה, צביעה בקריסטל ויולט (crystal violet) בלוחיות Irene מלוטשות בעלות 24 בארות מאפשרת ויזואליזציה מהירה של היווצרות ביופילם בתחתית כל בארה, כפי שניתן לראות מההבדל בעוצמת הצבע הסגול. נראה כי זן הטיפוס (wild type) הוא פחות דביק מהזן ההנדסי. שיטה כמותית היא מדידת אחוזי ההיצמדות לפוליסטירן של זן הטיפוס והזנים ההנדסיים בריכוזים שונים של קובלט.

התוצאות המוצגות בגרף זה מגלה כי אחוז ההיצמדות של הזן המהונדס גבוה פי 1.5 מזה של זן הטיפוס הפראי בהיעדרו של קובלט. בנוסף, נצפתה הגברה משמעותית של ההיצמדות בנוכחות ריכוזים עולים של קובלט; במצעים עם ריכוזי קובלט של 25 micromolar או 50 micromolar, אחוזי ההיצמדות של התאים המהונדסים מגיעים ל-30% ו-40% בהתאמה. ניתן להשוות את יכולות ההיצמדות גם באמצעות מיקרוסקופיה עם חיידקים המסומנים ב-GFP שגודלו על תויות זכוכית; תצפיות במיקרוסקופיית epi fluorescence של חיידקים ירוקים על רקע שחור מגליות כי הזן המהונדס יוצר ביופילם, בעוד שזן הטיפוס הפראי יוצר רק מיקרו-מושבות המסומנות על ידי החצים.

ניתוח במיקרוסקופיה קונפוקלית מספק מבט כולל על המבנה התלת-ממדי של הביופילם. שחזורי מבט עליון מוצגים בלוחות A ושחזורי מבט צד מוצגים בלוחות B. התוצאות מאשרות כי הזן ההנדסי הוא בעל כושר היצמדות גבוה יותר ומגבש ביופילם דחוס ועבה יותר מאשר זן הבר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבדוק שוב את תכנון הפעולה, למשל, כדי לבחון את פוטנציאל התיווך הביולוגי של e coli או occus ants משופרים בהקשר של מי שפכים רדיואקטיביים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי תכנון של רצף סינתטי באמצעות תוכנת clone manager וכיצד לכמת במהירות את הביטוי של זני חיידקים. זכרו כי עבודה עם גנים סינתטיים ועם אורגניזמים שעברו שינוי גנטי עלולה להיות מסוכנת ביותר. עליהם להיות מנוהלים בהתאם לחוקים הנוכחיים, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עיקור באוטוקלאב של חיידקים שעברו טרנספורמציה, בעת ביצוע הליך זה.