דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre
5 במרץ 2013
פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לגזור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (H PSCs) לנוירונים באמצעות פורמט של פלטת טיטראציה מרובה. דבר זה מושג על ידי קציר והזרקה של תרחיף תאים בודדים של H PSCs לתוך פלטות 96 בארות בעלות תחתית בצורת V, כדי ליצור גופי עובר (EBs) במהלך הלילה.
בשלב הבא, מעבירים את ה-EBS לפלטות בצורת U בעלות היספחות נמוכה מאוד (ultra-low attachment) המכילות מצע דיפרנציאציה, כדי להשרות היווצרות של נוירואקטודרם. לאחר מכן, זורעים את ה-EBS בצלחות מצופות מטריג'ל (matrigel) כדי לעודד צמיחה של נוירונים. ניתן לקבל תוצאות המראות נוכחות של סממנים נוירונליים טיפוסיים סביב היום השמיני באמצעות אימונופלואורסצנציה.
פרוטוקולי צביעה להבחנה של תאי גזע אנושיים פלוריפוטנטיים לנוירונים הם לרוב מורכבים ומייגעים. באופן מקרי למדי, נתקלנו בהליך פשוט מאוד להפקת נוירונים מתאי גזע אנושיים פלוריפוטנטיים.
מנקודת מבט טכנית, היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא קלה לביצוע, מהירה ויעילה מבחינת עלות. במקביל, את הפרוצדורה יעביר ד"ר MI Z מהמעבדה. הכין מצע להיווצרות EB ומצע דיפרנציאציה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.
גדלו תאי PSCs אנושיים בתנאים ללא תאי מאכיל (feeder free), כגון מצע גידול מותנה ב-meth על צלחות מצופות matrigel, או באמצעות מערכות תרבית מוגדרות כימית בתנאי צמיחה פעילים מתחת לסף התבכירות (sub confluent). הסירו מכנית מושבות שהבדילו באופן ספונטני באמצעות מיקרוסקופ סטריאו וקצה של פיפטת פלסטיק סטרילית. שטפו את המושבות הבלתי מובדלות שנותרו ב-PBS והשתמשו ב-Accutane המכיל 1x rock inhibitor לפירוק לתאים בודדים.
שקעו את התאים הבודדים על ידי סנטריפוגציה ב-200 G למשך שתי דקות והשעיו אותם בנפח קטן של מצע ליצירת EB. השתמשו במכשירי ספירת תאים (hemocytometer) כדי לקבוע את ריכוז התאים. הוסיפו תאים נוספים למצע יצירת ה-EB שנותר עד להגעה לריכוז של בין 40,000 ל-80,000 תאים למילילטר.
בעזרת פיפט רב-ערוצי, העבירו 100 µL לכל באר בלוח 96 בארות בעובי תחתון (V bottom plate), כך שיהיו 4,000 עד 8,000 תאים לבאר. סבבו את הלוח בצנטריפוגה ללוחות עם ראש נתיב (swing up plate centrifuge) ב-400 G למשך דקה אחת כדי לרכז את כל התאים בתחתית הבארות. העבירו את התאים לאינקובטור והמתינו למשך הלילה להיווצרות EBS; ביום למחרת, בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
אספו את ה-EBS והעבירו בנפח קטן לצלחת חיידקים בקוטר 3.5 סנטימטר המכילה שני מיליליטר של מדיום דיפרנציאציה. שטפו את התאים על ידי סיבוב עדין של הצלחת. הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום דיפרנציאציה לכל באער בלוח בעל הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment).
תחתית של פלטת 96 בארות תחת מיקרוסקופ סטריאו. העבירו EBS בנפחים קטנים מכלי השטיפה אל תוך 96 בארות מסוג U. דגרו את ה-EBS במשך ארבעה ימים כדי לאפשר היווצרות של נוירואקטודרמה (neuroectoderm) ביום הרביעי.
שטפו את התאים במדיום דיפרנציאציה וזרעו אותם אחד אחד לתוך בארות של פלטה רב-תאית מצופה במטריג'ל (matrigel), כגון פלטה בעלת 12 בארות. יש להפיץ את התאים באופן שווה בתוך הבארות כדי לאפשר צמיחה רציפה של נוירונים. השאירו את ה-EBS להיקשר באופן רפוי למטריג'ל למשך כ-10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, העבירו בזהירות את הפלטה לאנקובטור. נוירונים יצמחו מה-EBS שהוצבו בפלטה באופן רדיאלי במהלך ארבעת הימים הבאים. בעבר הראינו, בדומה למחקרים רבים אחרים, כי ניתן להפיק EBS מתאי H PSCs פשוט על ידי זריעה מחדש של אגרגטים בעת פיצול שגרתי של H HPCs לתוך כלי בעלי הידבקות נמוכה.
דבר זה מוביל בדרך כלל להתפלגות רחבה של גדלי תאים. בעיה נוספת היא ש-EBs המתוחזקים בסספנסיה נוטים להתרקב זה עם זה, מה שמוביל להטרוגניות גבוהה עוד יותר בגודל. כדי לעקוף זאת, ה-hPSCs הוכנסו לבארים בעלות הידבקות נמוכה, דבר שהוביל להיעדר היווצרות של EBs ולמוות של התאים. עם זאת, שילוב של המולקולה להישרדות תאים, Y 2 7 6 3 2, עם polyvinyl alcohol, אשר הוכח כמשפר את היווצרות ה-EBs מ-hPSCs, אפשר ל-EBs להיווצר מסספנסיות של תאי hESC בודדים במהלך הלילה.
באופן נוח, ניתן היה לשלוט באופן הדוק בגדלי ה-EB בפורמט של פלטת ריכוזים מרובה זו על ידי הצבת מספרים שונים של תאים לכל באר. בניגוד לשימוש בטכניקות קונבנציונליות, לאחר העברת ה-EBs לפלטות 96 בארות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד, ה ownהוצרה של הנוירואקטודרמה הונעת באמצעות תערובת של מולקולות קטנות המורכבת ממעכבי F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA two ו-BP SMA one, מה שאיפשר לאחר מכן לזרוע את התאים על matrigel כדי להביא להיווצרות נוירונים. התחלת היווצרות ה-EB מכ-8,000 תאים הניבה את יכולת הבידול הנוירונלית הטובה ביותר, המאופיינת בצמיחה נוירונלית בולטת מה-ebs הזרועים.
מרכזי EB נמקרוטיים מופחתיים לאחר הזריעה וביטוי גבוה של סממנים תחושתיים ופנ-נוירונליים כגון B rrn three A ו-beta three tubulin. נראה כי יעילויות ההבחנה הנוירונלית הכוללות דומות לפרוצדורה המקורית, אשר ישימה עד כה הן עבור HSCs והן עבור HI PSCs. שלושה קווי HPSC בלתי תלויים, תאי HES וכן תאי HIPS, נבחנו בהצלחה בפרוצדורה הרב-בארית, בעוד שבאופן כללי לא ניתן לשלול שונות התלויה בקו התאים ויעילויות הבחנה משתנות.
איור זה מציג תאים נוירואקטודרמליים בודדים ומפוylיים מהיום הרביעי, אשר נזרעו כתאים בודדים והבדילו בהצלחה ביעילות של כ-60%. הטיפול ב-EBS בפלטפורמת ה-multi titter דורש מעט אימון בהתחלה, אך לאחר זמן מה תראו שזה די פשוט.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול להפרדה של תאי גזע רב-עוצמתיים אנושיים (hPSCs) לנוירונים באמצעות פורמט צלחות רב-מידות. השיטה מפשטת את התהליך, מה שהופך אותו מהיר ויעיל תוך שמירה על שליטה בהפרדה.
רכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה של תאי גזע
- הפרדת תאים
רקע
- תאי גזע רב-עוצמתיים אנושיים (hPSCs) יכולים להתפצל לסוגי תאים שונים.
- פרוטוקולי הפרדה מסורתיים הם לרוב מורכבים וגוזלים זמן רב.
- ייצור יעיל של נוירונים הוא קריטי למחקר נוירולוגי.
- שימוש בפורמט צלחות רב-מידות יכול להקל על התהליך.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול מפושט להפרדה נוירונית של hPSCs.
- לאפשר יצירה מהירה של נוירונים באופן מבוקר.
- להקל על הגישה לתרבויות נוירוניות למטרות מחקר.
שיטות ששימשו
- קציר והנחת hPSCs לצלחות 96 בור עם תחתית V.
- היווצרות של גופי עוברים (EBs) במהלך הלילה.
- העברת EBs לצלחות בעלות תחתית נמוכה מאוד ומיוחדות בצורת U עם מדיום הפרדה.
- הנחת EBs על צלחות מצופות במטריגל כדי לקדם את צמיחת הנוירונים.
תוצאות עיקריות
- נוכחות של סמנים נוירוניים אופייניים שנצפו בערך ביום השמיני.
- אימונופלואורוסצנציה אישרה את ההפרדה הנוירונית.
- ייצור יעיל של נוירונים הושג באמצעות הפרוטוקול.
- השיטה מאפשרת יישומים בעלי תפוקה גבוהה במחקר.
מסקנות
- הפרוטוקול המותאם מספק דרך מהירה ויעילה להפקת נוירונים מ-hPSCs.
- שימוש בפורמט צלחות רב-מידות מפשט את תהליך ההפרדה.
- שיטה זו יכולה לשפר את יכולות המחקר בתחום הנוירולוגיה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, scalable generation of functional neurons from human pluripotent stem cells in a multi-titre plate format, addressing the need for efficient, reproducible neuronal models in early-stage drug discovery. By eliminating multi-step precursor expansion and using a chemically defined, small-molecule-based approach, it reduces technical complexity and supports mid-throughput screening applications. The method provides a de-risked source of human sensory-like neurons for target validation and phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuroectoderm induction and neuronal differentiation pathways using defined small-molecule inhibition of TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK signaling.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing in a 96-well format, reducing time from pluripotent stem cells to functional neurons to eight days.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces neurons expressing pan-neuronal (beta-III tubulin) and sensory (Brn3a) markers, suitable for screening compounds affecting neuronal maturation or function.
- Operational Value: Compatible with multi-titre plate formats, allowing standardized seeding, differentiation, and readout in V-bottom and ultra-low attachment plates for assay reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrated across three independent hPSC lines (HES and hiPSCs), supporting cross-line consistency for disease-relevant modeling.
- Operational Value: Enables scalable production of neurons for downstream functional assays, including electrophysiology or high-content imaging, without requiring specialized differentiation expertise.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through rapid neuronal differentiation and enabling lead identification via compound screening in a format compatible with automated liquid handling and imaging platforms.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by providing a defined system to study neuroectoderm formation and neuronal outgrowth from pluripotent stem cells.
- Screening: Yields adherent neurons from embryoid bodies plated on matrigel, allowing standardized compound exposure and phenotypic readout in multi-well formats.
- Analytics: Enables quantitative assessment via immunofluorescence for neuronal markers (e.g., beta-III tubulin, Brn3a) at day eight, supporting dose-response and hit confirmation.
- Translational Research: Uses human pluripotent stem cells to generate neurons with sensory neuron characteristics, offering translational relevance for peripheral nervous system targets.
- Enterprise Reuse: The multi-titre plate format supports assay standardization across teams and sites, reducing variability in neuronal differentiation for repeated screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in neuronal differentiation efficiency (~60% in optimized conditions) and marker expression reduces ambiguity in target engagement studies.
- Operational Value: Simple, chemically defined medium with small-molecule inhibitors eliminates need for complex growth factor changes or feeder layers.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in target validation by providing rapid access to functional human neurons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroscience targets through reproducible, scalable neuronal model generation.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture training for embryoid body handling and multi-titre plate transfers.
- Depends on access to V-bottom 96-well, U-shaped ultra-low attachment, and matrigel-coated plates for embryoid body formation and neuronal outgrowth.
- Necessitates standardization of small-molecule inhibitor concentrations (TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF/ERK) across batches for consistent neuroectoderm induction.
- Adaptation to other neuronal subtypes may require protocol optimization beyond the sensory neuron-biased output observed.
- Limited to adherent differentiation outcomes; not suited for suspension-based or 3D organoid applications without modification.
