המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להמיר בדיקת ELISA שעברה אופטימיזציה מראש עבור ציטוקין TNF Alpha לפלטפורמת Xap, תוך הערכה של זוגות נוגדנים חלופיים. דבר זה מושג על ידי צימוד הנוגדן התופס (capture antibody) מערכת ה-ELISA, יחד עם שלושה נוגדנים תופסים מועמדים אחרים, לארבעה סטים שונים של מיקרוספירות או חרוזיים כאשר הם מעורבבים יחד. ארבעה סטים אלו מאפשרים בדיקה סימולטנית של כל ארבעת המועמדים עם ארבעה נוגדני זיהוי נפרדים, כדי לקבוע את זוג הנוגדנים המיטבי.

שני בדיקות ה-Xap הבאות נבנות עם שני זוגות הנוגדנים האופטימליים ביותר. לאחר מכן, ביצועי הבדיקות מושווים לאלו של בדיקת ה-EISA המקורית ביחס לעוצמת האות, לטווח הדינמי ולרגישות. התוצאות מראות שנוגדנים דומים יכולים להפגין ביצועים שונים מאוד תחת אותם תנאים, וכי ניתן לסנן מספר נוגדנים בו-זמנית באמצעות בדיקת ה-Luminex Xap, מה שמעיד כי לבדיקה זו רגישות וטווח דינמי מוגברים בהשוואה ל-EISA.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון EIS A הוא שבדיקות אימונו-סיי (immunoassays) המבוססות על xap מאפשרות לחוקר לבחון מספר יעדים, או במקרה זה, לבחון מספר נוגדנים בו-זמנית. כדי לזהות את הנוגדן הטוב ביותר שהוצג, הפרוצדורה תבוצע על ידי אריקה לופז, מדענית שותפה ב-Luminex Corporation.

התחילו פרוטוקול זה בבחירה והכנה של ארבעה נוגדני לכידה וארבעה נוגדני זיהוי הספציפיים ל-TNF alpha אנושי, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כמו כן, הכינו נוגדן אישור אחד הספציפי למין המארח של נוגדני הלכידה. הביאו את الريאגנטים בערכת הצימוד של הנוגדנים לטמפרטורת החדר.

סמנו ארבעה מבחנות תגובה עם מספרי אזורי החרוצים שנבחרו לתגובת הצימוד. העבירו את תכולת ארבעת הבקבוקונים של מיקרוספירות mag plex לארבעת מבחנות התגובה המסומנות. שטפו כל אחת מקבוצות החרוצים פעמיים ב-500 µL של בופר אקטיבציה והפעילו כל קבוצת חרוצים באמצעות תמיסות sulf ONHS ו-EDC כפי שמתואר בערכת הצימוד לנוגדנים.

מדריך למשתמש: לאחר דגירה של 20 דקות על רטט (rotator), חזור על שלב השטיפה הקודם עם החרוזיים הפעילים כעת סך הכל שלוש פעמים עם 500 µL של בופר הפעלה. עבור כל שטיפה, הכן ארבעה תמיסות נפרדות של 500 µL, שכל אחת מהן מכילה 7.5 µg של נוגדן לכידה בבופר ביטול פעילות.

הוסיפו את ארבעת התמיסות של הנוגדי הלכידה לפרבורות התגובה המתאימות. ערבבו כל פרבורה במערבל Vortex באופן מיידי והדגרימו למשך שעתיים על רוטטור. חזרו על שלב השטיפה עם החרוזים המצומדים כעת סך כולל של שלוש פעמים, באמצעות 500 µL של תמיסות השטיפה המצורפת לערכת הצמיד הנוגדנים.

לאחר שלב השטיפה האחרון, הוסיפו 500 microliters של בופר שטיפה לכל מבחנת תגובה כדי להגיע לריכוז מלאי סופי של 5 מיליון חרו지를 המצומדים לנוגדנים ל-milliliter, ערבבו ב-vortex, ולאחר מכן בצעו סוניקציה למבחנות התגובה כדי לפזר את החרוזים. ספרו את מספר החרוזים שהופקו לאחר תגובת הצימוד באמצעות סופר תאים או hemo cytometer. שיעור ההשבה מתגובת הצימוד הוא בדרך כלל מעל 90%. ודאו כי תגובת הצימוד הצליחה על ידי הכנת תמיסות בדיקה של מלאי החרוזים המצומדים עבור כל סט, בריכוז סופי של 100 חרוזים ל-microliter בבופר בדיקה, והכינו דילול של FICO erything labeled antis species.

הוסף נוגדן אישור IgG בריכוז של 4 µg/mL בבופר בדיקה (assay buffer). העבר aliquots של 50 µL מכל תמיסת בדיקה לארבעה בארות של פלטה בעלת 96 בארות עם תחתית עגולה, לסך של 16 בארות. לאחר מכן, הוסף 50 µL של בופר בדיקה לשמונה מהבארות למדידת הרקע, ו-50 µL של נוגדן אישור מדולל לשמונה הבארות שנותרו. ערבב את התגובות בעדינות על ידי פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות פטנטה רב-ערוצית.

כסו את הפלטה והדגרימו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מערער פלטות. הניחו את הפלטה על מפריד מגנטי לפלטות למשך דקה עד שתיים כדי למשוך את החרוזים מתוך התמיסה. לאחר מכן, הסירו את הנוזל על ידי הפיכה נמרצת של הפלטה בזמן שהיא על המפריד מעל מיכל פסולת.

שטפו כל באר פעמיים על ידי הוספה של 100 µL של באפר בדיקה (assay buffer) והסרת ה-SANE מהפלטה באופן דומה. בעזרת מפריד פלטות מגנטי, השעו שוב את החרוזים ב-100 µL של באפר בדיקה על ידי פיפטור עדין מעלה ומטה חמש פעמים באמצעות פיפט רב-ערוצי. נתחו את הדגימות במכשיר luminex xap, כגון מכשיר magix.

עוצמת האות הפלואורסצנטי של תגובה זו פרופורציונלית ישירות לכמות החלבון על פני השטח של החרוזים, דבר המאפשר הערכה מהירה של כמות החלבון היחסית שהוצמדה לחרוזים. כדי לקבוע את זוג הנוגדנים היעיל ביותר בבדיקת ה-xap, הכינו תערובת ראשונית של כל ארבעת סטים של החרוזים על ידי הוספת 10 µL מכל אחד ל-0.96 mL של באפר בדיקה. הכינו את תמיסות הנוגדנים הגילוי על ידי דילול של כל נוגדן ל-1 µg/mL בבאפר בדיקה.

גם זהו בופר מדידה. הכין את סטנדרט חלבון TNF alpha מבית r and d systems בריכוז של 2000 picograms per milliliter ומדלל את ה-Streptavidin R FICO eryn לריכוז של eight micrograms per milliliter. הוסף 50 microliters של תערובת חרוזיים מצומדים לנוגדן לכל אחת מ-16 הבארים בלוח CoStar בעל תחתית עגולה עם 96 בארים עבור בדיקת הסריקה.

לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של באפר בדיקה לשמונה מתוך 16 הבארים כדי למדוד את הרקע. לאחר מכן, טפטפו 50 µL של סטנדרט TNF alpha לשמונה הבארים הנותרים כדי למדוד את התגובה. דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, מוגנים מאור, תוך כדי ניעור על מערער פלטות בדיקה.

לאחר מכן, הוסיפו 50 µL מכל אחד מארבעת הנוגדנים לגילוי לארבעה בארות, כאשר שתיים מהן הן בארות רקע ושתיים הן בארות תגובה. דגרו למשך 30 דקות תחת אותם תנאים, ולאחר מכן הוסיפו 50 µL של ריאגנט SAPE לכל הבארות. דגרו שוב למשך 15 דקות תחת אותם תנאים.

הנח את הפלטה על מפריד מגנטי לפלטות למשך דקה אחת. לאחר מכן, הסר את הנוזל על ידי היפוך נחרץ של הפלטה בעודה על המפריד מעל מיכל פסולת. העבר בפיפט 100 µL של באפר תגובה (assay buffer) לכל אחת מ-16 הבארות.

לאחר מכן, הסירו את הנוזל מהחרוזים באמצעות הפרדה מגנטית. כעת, הוסיפו 100 µL של בופר בדיקה לכל אחת מ-16 הבארות. קראו את הפלטה באמצעות מכשיר ה-Luminex mag picks בהתאם למדריך למשתמש להפעלה נכונה.

בחרו זוג נוגדנים העומד בעוצמת האות הרצויה. לאחר בחירת הנוגדן הטוב ביותר ללכידה (capture antibody), דללו 100 µL ממלאי הנוגדנים המשוררים לחרוזים ל-10 mL עם באפר למסיי (assay buffer). הוסיפו 50 µL מהחרוזים המדוללים ל-78 בארות של שתי פלטות CoStar בעלות 96 בארות עם תחתית עגולה.

כל פלטה תשמש להערכת הביצועים של נוגדן זיהוי שונה. לאחר מכן, הכינו עקומת סטנדרט בת 12 נקודות, המתחילה ב-8,000 picograms per milliliter ומסתיימת בארבעה picograms per milliliter, באמצעות מערכות r and d.

הוסיפו שש חזרות של 50 µL של כל דילול של סטנדרט TNF Alpha לכל אחת מהלוחיות, בתוספת שש בארות עם 50 µL של באפר בדיקה (assay buffer) לכל אחת כרקע, לסך של 78 בארות ללוחית. דגרו את הלוחיות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, במוגנות מאור, תוך써 ניעור על מכשיר ניעור ללוחיות בדיקה. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של הנוגדן הראשוני לגילוי לכל 78 הבארות של הלוחית הראשונה.

חזור על הפעולה עבור נוגדן הגילוי השני בפלטה השנייה. דגור את הפלטות למשך 30 דקות תחת אותם תנאים. לאחר מכן, הוסף 50 µL של ריאגנט ה-SAPE לכל הבארים בכל פלטה.

לאחר ניעור של שתי הפלטות למשך 15 דקות תוך הגנה מאור, הניחו את הפלטות על מפרידי פלטות מגנטיים למשך דקה אחת. הסירו את הנוזל על ידי היפוך נמרץ של הפלטה בעודה על המפריד, מעל מיכל פסולת. לאחר מכן, טפטפו 100 µL של באפר בדיקה (assay buffer) לכל אחד מ-78 הבארים שבפלטות, לפני הסרת הנוזל מהחרוזיים המגנטיים כפי שבוצע קודם לכן.

לאחר הוספת 100 µL של באפר בדיקה (assay buffer) לחרוזים בכל אחד מ-78 הבארים בלוחיות, נתחו את הלוחיות במכשיר ה-mag picks בהתאם למדריך למשתמש להפעלה נכונה. פעלו לפי ההוראות המצורפות לערכת ה-ELI A מסוג human TNF Alpha T NF SF one a DUO set של r and d systems. מדדו את התגובה שנוצרה על ידי הסטנדרט שסופק עם ערכת r and d.

חזור על בדיקת ה-ELI a שלוש פעמים נוספות, כאשר תחליף את הנוגדנים ללכידה ולזיהוי של r and d systems בנוגדנים של הספקים האחרים. לצורך הפשטות, จับ את הנוגדנים לפי ספק, והערך כל זוג באופן עצמאי כפי שנדרש בפורמט ה-EISA עם כל אחד משלושת סטנדרטים של חלבון TNF Alpha. בדיקות Luminex Xap בוצעו כ-multiplex כדי להעריך את כל ארבעת הנוגדנים ללכידה כתערובת, על ידי שילוב של ארבעה סטים של נוגדני TNF alpha המצומדים למיקרוספירות Mag PLX; הנוגדנים ללכידה הוערכו עם כל אחד מארבעת הנוגדנים לזיהוי הביוטיניליים באופן פרטני, כך שניתן היה לקבוע בו-זמנית את האינטראקציה של נוגדן זיהוי אחד עם כל אחד מארבעת הנוגדנים ללכידה.

התוצאות הצביעו על כך שזוג הנוגדנים מהסט DUO של r and d systems הניב את הביצועים הטובים ביותר, עם תגובה של 6,183 יחידות של עוצמת פלואורסצנציה חציונית או MFI. כמו כן, נצפה כי הנוגדנים לזיהוי מ-Millipore ו-ABAM סיפקו תגובה סבירה בבדיקת ה-XAP כאשר שולבו עם הנוגדן ללכידה של RD systems; לעומת זאת, הנוגדנים ללכידה מ-Millipore, ACAM ו-Novus הניבו תגובה פחות רצויה בבדיקת ה-XAP. פרוטוקול הסט DUO של r and d systems שימש להשוואה בין ארבעת זוגות הנוגדנים בפורמט EISA.

הפרוטוקול של r and d systems שימש עבור כל זוגות הנוגדנים מכיוון שהוא משקף פרוטוקולי EIA טיפוסיים הנפוצים כיום, והוא אנלוגי לפרוטוקולים המשמשים בטכנולוגיית xap. בדיקות ה-EISA הראו כי שוב זוג הנוגדנים מ-r and d systems הניב את התוצאות הטובות ביותר. זוג הנוגדנים מ-Acam לא הפיק תגובה, וזוגות הנוגדנים מ-Millipore ומ-Novas הפיקו תגובות צנועות, וזאת על מנת להעריך וריאציה כלשהי בריאקטיביות של הנוגדנים.

באמצעות הסטנדרט, כל ארבעת זוגות הנוגדנים נבדקו עם שלושה סטנדרטים שונים של חלבון TNF alpha רקומביננטי משלושה ספקים שונים. הנתונים מראים כי הסטנדרטים של חלבון TNF alpha רקומביננטי משלושת הספקים הניבו תוצאות שקולות. חלבון ה-TNF alpha מ-r and d systems שימש ליצירת עקומות סטנדרט עבור בדיקות ה-ELSA וה-XAP.

בעוד שבדיקת ה-ELI A בוצעה באמצעות זוג הנוגדים של r and d system, בדיקות ה-xap השתמשו בנוגדן הלכידה של r and d system ובנוגדן הגילוי מ-r and d systems או מ-Millipore. חלבון TNF alpha מ-r and d systems דולל כדי להפיק טווח ריכוזים מ-8,000 ועד ארבעה picograms per milliliter בלבד. זוג הנוגדים מ-r and d systems הניב את התוצאה המצופה בבדיקת ה-Xap, עם תגובה הגבוהה מ-20,000 MFI כפי שמוצג.

כאשר נעשה שימוש בנוגדן הגילוי מ-Millipore בבדיקת ה-Xap במקום בנוגדן הגילוי של r and d systems, התגובה הייתה כ-30% מהתגובה שהתקבלה עם נוגדן הגילוי של RD systems. הקו הירוק בתרשים זה מייצג את עקומת הסטנדרט של ה-ELA, שטווח ה-TNF alpha המומלץ על ידי היצרן עבורה היה בין 16 ל-1000 picograms per milliliter. בשל מגבלת הספקטרופוטומטר, לא ניתן היה להרחיב את הטווח של בדיקת ה-Eliza.

יתרה מכך, הטווח הדינמי והרגישות של שתי השיטות מודגמים בצורה טובה יותר כאשר הם מוצגים בסולם לוגריתמי. ניתן לראות הבחנה ברורה בין השיפוע של תגובת ה-EISA לבין התגובות של בדיקות ה-xap, דבר המצביע על יכולת גילוי מוגבלת יותר של TNF alpha בשיטת ה-EL iza הן בריכוזים גבוהים והן בריכוזים נמוכים. גבולות הגילוי או ה-LOD של שתי בדיקות ה-xap התפקודיות ל-TNF alpha הוערכו באמצעות זיהוי ריכוז ה-TNF alpha הנמוך ביותר שבו נצפתה רמת תגובה הגבוהה מהרקע, בתוספת פי שלושה מסטיית התקן שלו או ה-SD משש חזרות.

ניתן להבחין כאן כי בעת שימוש בזוג של r and d systems, ריכוז ה-TNF alpha הנמוך ביותר, 3.91 picograms per milliliter, הניב תגובה של 66 MFI, שהיא גבוהה מהתגובה עבור הרקע בתוספת של שלוש SD, ובכך עומדת בקריטריון זה. כאשר נעשה שימוש בנוגדן הגילוי של millipore יחד עם נוגדן הלכידה של r and d systems, גבול הגילוי היה נמוך מ-7.81 picograms per milliliter.

במקרה זה, ריכוז ה-TNF alpha השני הנמוך ביותר שהפיק תגובה מקובלת היה 17 MFI, ערך הגבוה מהתגובה של ריכוז ה-TNF alpha הנמוך ביותר בתוספת פי שלושה מסטיית התקן שלו. באופן דומה, גבול הגילוי עבור ערכת ה-ELISA מסוג duo set של r and d systems נאמד בין 63 ל-31 פיקוגרם למיליליטר. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שלבים נוספים כגון בדיקה של מטריצות דגימה שונות או ריכוזים שונים של נוגדנים בתוך ה-reporter, וזאת כדי להבטיח אופטימיזציה נוספת של בדיקת ה-xap.