הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

המטרה הכללית של הליך זה היא לגלות תרכובות חדשות המודולות את הפעילות של תעלות אשקום מסוג inward rectifier. מטרה זו מושגת תחילה על ידי זריעה של תאי HK 2 9 3, המופעלים על ידי טטרהציקלין ומבטאים תעלת KIR רלוונטית, לתוך פלטת 384 בארות. השלב השני הוא טעינת התאים בצבע รายงาน פלואורסצנטי של תליום הנקרא flu in two.

בשלב הבא, שוטפים מהתאים את הצבע שלא נקשר ומחליפים אותו בתמיסת Assay המכילה ביקורת Vehicle או תרכובות לבדיקה. השלב האחרון הוא הוספת תמיסת גירוי (stimulus buffer) לבארים כדי להתניע את זרימת הטאליום. לבסוף, משתמשים בקורא פלטות פלואורסצנציה כדי לזהות את התרכובות המשנות את תנועת יוני הטאליום דרך תעלת ה-KIR.

היתרון המרכזי של שיטה זו על פני טכניקות קיימות, כגון אלקטרופיזיולוגיה של patch clamp ידנית, הוא שהיא מאפשרת לחוקר לבצע מאות ניסויים בו-זמנית ואלפי ניסויים מדי יום. שיטה זו מאפשרת לחוקר לסרוק ספריות של אלפי מולקולות קטנות כדי לגלות מודולטורים של תעלות אשומה (potassium channels) בעלות מוליכה פנימה (inward rectifying). יום לפני ניסוי זרימת התליום, יש להפריד את התאים ולכמת את צפיפות תרחיף התאים כפי שמתואר בכתב העת המצורף. לאחר מכן, השתמש במדיום BH המכיל 10% dialyzed FBS כדי להוסיף 20,000 תאים מונוקלונליים שעברו טרנספקציה יציבה של גן תעלת KIR רלוונטי לכל באר של פלטת BD pure coat Amin בעלת 384 בארות, באמצעות thermo multi drop combi או פיפטה רב-ערוצית. למחרת, יש לבחון את הפלטה תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים הדבקו ומפוזרים באופן אחיד על פני תחתית הבארות.

לאחר מכן, השתמש בשוטף מיקרו-פלייטים ELX 4 0 5 כדי להחליף את מצע תרבית התאים בבופר HBSS assay בנפח של 20 microliters לבאר. לאחר מכן, הכן את תמיסת הטעינה flus in 2:00 AM D על ידי צנטריפוגה קצרה של המבחנה להמסה של 50 micrograms של אבקת flus in two ב-100 microliters של DMSO ללא מים.

כעת הוסף 50 µL של תמיסת DMSO בריכוז 20% weight per volume onic F1 27 לצבע. ערבב אותם באמצעות פיפוט עדין. לאחר מכן, הוסף 150 µL של flus in 2:00 AM onic F1 27 ל-35 mL של תחליל HBSS assay, buffer וערבב בעדינות.

בשלב הבא, הוסיפו 20 µL של תמיסת טעינה עם צבע לכל באער שכבר מכיל 20 µL של HBSS assay.Buffer. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך כשעה, בזמן שהתאים נטענים בצבע. הכינו פלטת גירוי תליום על ידי המסה רגעית של 0.5 g של נתרן ביקרבונט ב-50 mL של תמיסת גירוי תליום 5x.

לאחר מכן, יש להוסיף 50 µL מהתמיסה לכל באר של פלטת פוליפרופילן בעלת 384 בארות. לאחר שהתאים נטענו בفلوس (flus) ב-2:00 AM, יש לשטוף את הפלטה באמצעות שוטף מיקרו-פלטות ELX 4 0 5. לאחר מכן, יש להוסיף 20 µL או 40 µL של HBSS assay Buffer חזרה לכל באר, והפלטה מוכנה כעת לניסויים.

העמידו את פלטות ה-thallium והתאים במערכת לסריקת תרופות פונקציונלית מסוג Hema Matsu או בקורא פלטות עם דימיג קינטי שווה ערך בעל יכולות חלוקת נוזלים מובנות, והשתמשו במסננים מתאימים לצבעים מבוססי פלואורסצאין כגון flu oh four. לאחר מכן, הגדירו פרוטוקול הוספה בודדת (single add) להוספת 10 µL של סדרת Thallium בריכוז five X לבארות המתאימות בפלטת התאים המכילה 40 µL של בופר HBSS assay. לאחר מכן, רשמו את פלואורסצנציית הבסיס בתדירות דגימה של 1 Hz למשך 10 seconds לפחות.

הפלואורסצנציה בין הבארות צריכה להיות אחידה ויציבה לכל אורך הפלטה לאחר קביעת תנאי זריעת התאים, השטיפה והטעינה האופטימליים. בינתיים, השתמשו בפיפט 384 הערוצים המובנה כדי להוסיף את באפר גירוי ה-thallium לכל בארה בו-זמנית, והמשיכו בהקלטה למשך שתי דקות לפחות, כך שקצב ושיא העלייה בפלואורסצנציה המושרית על ידי thallium ייתפסו לצורך ניתוח לא מקוון (offline).

השתמשו בפיפט רב-ערוצי. הכינו פלטת תרכובות DMSO על ידי פיפטור של מעכב לערוץ ה-KIR המטרה בריכוז שנקבע בעבר, בנפח של 80 microliters לבאר, ושל 0.1%DMSO vehicle אל תוך פלטת פוליפרופילן בעלת 384 בארות. פעולה זו מבוצעת על ידי הוספת מעכב ידוע החל מבאר A1, ובחלוקה לסירוגין לבאר B2, וכן הלאה עד לבאר B 24.

חזור על הליך זה עם DMSO, החל מבאר B1 וכן הלאה עד לבאר A24. כעת, העמס את לוחיות התאים, התרכובות והגירוי בתליום אל קורא הלוחיות. לאחר מכן, הגדר פרוטוקול הוספה כפול (two add) להוספת 20 µL של סדרת התרכובות בריכוז 2X לבארי התאים המתאימים, המכילים 20 µL של תמיסת HBSS assay buffer.

הוסיפו את התרכובות לפלטת התאים והדגירו אותן למשך עד 20 דקות בטמפרטורת החדר. רשמו את רמות הפלואורסצנציה הבסיסיות בשני ערוצי פלואורסצנציה למשך 10 שניות לפחות. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של תמיסת באפר תליום ריכוז 5x לכל באר בפלטת התאים.

חזור על הניסוי שלושה ימים רצופים כדי לבסס את השחזוריות של התוצאות. השתמש בזרימת תליום ב-DMSO ובתאים שטופלו בתרופה כדי לחשב ערך עבור Z prime. מדד סטטיסטי של השונות בין באריות בקרב שתי אוכלוסיות הבאריות; חשב את Z prime באמצעות נוסחה זו המבוססת על הממוצעים וסטיות התקן של P ו-N, כאשר P הוא ערך הזרימה ללא עיכוב ו-N הוא ערך הזרימה עם עיכוב מלא.

בדיקה עם ערכי ZPrime הגדולים או השווים ל-0.5 בשלושה ימים נפרדים נחשבת כמתאימה לסריקה בשריח גבוה (high throughput screening). איורים אלו הם דוגמאות למפות פריסת תאים שנעשה בהן שימוש בסוגים שונים של ניסויים. מיקומי הבארים המכילות תאים ללא השראה או תאים שהושרו באמצעות טטרציקלין מסומנים בצבעים שונים.

איור זה מציג את מפת פלטת המקור ששימשה לקביעת ריכוז התליום האופטימלי לפיתוח הבדיקה ולסריקת תרכובות. מדרג הצבעים מייצג סדרת דילול פי שלושה הנעה בין 100% ל-0.002% תליום, וכאן מוצגת מפת עוצמת פלואורסצנציה מייצגת עם צבעים קרים עד חמים, המצביעים על ערכי שטף תליום נמוכים עד גבוהים. מפת פריסת התאים המוצגת כאן, עם התאמה של פונקציה לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים לעקומת כיול הריספונס (CRC) של התליום, משמשת לקביעת ערך EEC 80 של 15% תליום.

איור זה מציג את מפת פלטת המקור ששימשה לקביעת הסבילות ל-DMSO של הבדיקה. עמודות 1 ו-24 מכילות תמיסת בפר בלבד, בעוד שמסגרת הצבעים מצביעה על סדרת דילול דו-מכפלית הנעה בין 10% ל-0.01% DMSO; כאן מוצגת מפת עצימות פלואורסצנציה מייצגת, שבה ערכי שטף thallium נמוכים מסומנים בכחול כהה יותר. ערכי שטף thallium הממוצעים שנמדדו מהבארים המכילות את ריכוזי ה-DMSO המצוינים מסוכמים כאן.

כעת דמות זו מציגה את מפת לוחית המקור ששימשה להקמת עקומות תגובה לריכוז עבור מעכבים ידועים של תעלת KIR. כל תרכובת מסומנת בצבע שונה ובדרך כלל מועברת ללוחית כסדרה של דילול פי שלושה. מפה מייצגת של עוצמת פלואורסצנציה מוצגת כאן, ודמות זו מראה את העיכוב התלוי במינון של זרימת תליום על ידי המעכב לאחר פיתוחו ואופטימיזציה שלו.

ניתן להשתמש בבדיקת שטף התליום גם לביצוע מגוון בדיקות פרמקולוגיות שגרתיות. בדיקת שטף התליום הותאמה בעבר לשימוש עם תעלות אשלגן תלויות-מתח ותעלות אשלגן מקושרות, תעלות קטיונים לא סלקטיביות, ואפילו נשאי אשלגן. אין לשכוח שעבודה עם תליום עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש בכפפות וסלקה נאותה של הפסולת, בעת ביצוע הליך זה.