חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד חומצות גרעין מוכנות ל-PCR וחלבון אימונו-ריאקטיבי מדגימה, ללא צורך בחשמל או בתשתית מעבדתית. בידוד חומצות הגרעין והחלבונים מתחיל בערבוב הדגימה עם גואנידין ותיוציאנט כדי ללוות את הדגימה, והעברת התערובת על פני הסורבנט בפיפטת המיצוי. לאחר המעבר החמישי והסופי על פני הסורבנט, העבירו את התערובת למסייד חלבונים (protein extraction buffer) והפרידו אותה לצורך בידוד החלבון האימונו-ריאקטיבי.

בשלב הבא, שוטפים את הסופח ואת החומצות הגרעיניות הקשורות אליו על ידי העברת 95% ethanol על הסופח. לאחר מכן, מייבשים את הסופח ואת החומצות הגרעיניות הקשורות מספר פעמים על ידי העברת אוויר בטמפרטורת החדר על הסופח למשך חמש דקות. השלב האחרון בבידוד חומצות גרעיניות המוכנות ל-PCR הוא אלוציה של החומצות הגרעיניות מהסופח באמצעות 250 µL של tris או תמיסה מימית דומה אחרת לבידוד החלבון האימונוריאקטיבי.

לאחר ערבוב הדגימה עם בופר מיצוי החלבון, השתמש בפפיטה מיצוי שנייה והעבר את התערובת על הסורבנט 15 פעמים. השלב הבא הוא שטיפת הסורבנט עם החלבון הקשור על ידי העברת 95% ethanol על הסורבנט מספר פעמים. לאחר מכן, מייבשים את הסורבנט ואת החלבון הקשור על ידי העברת אוויר בטמפרטורת החדר על הסורבנט למשך חמש דקות.

השלב האחרון של הפרוטוקול הוא אלוציה של החלבון מהסורבנט. בסופו של דבר, פפיטת המיצוי המשמשת בהליך זה מאפשרת בידוד של חומצות גרעיניות מוכנות ל-PCR וחלבון אימונו-ריאקטיבי ללא שימוש בחשמל. היי, שמי דייב פולובסקי.

אני מדען מחקר בכיר ב-Kubrick Incorporated בבאפלו, ניו יורק, והיום נלמד טכניקה שתבודד הן חלבונים והן חומצות גרעיניות באופן מקוון, ללא צורך בצנטריפוגה, בוורטקס או בכל ציוד מעבדה חיצוני אחר. לפני ליזיס של הדגימות, ודאו שהדגימות הן בצורה נוזלית. אם הדגימה מוצקה, לדוגמה, מזון או צואה, יש להשעות את הדגימה במצע נוזלי כגון מים או תמיסת סליין עם בופר פוספט (phosphate buffered saline).

ערבבו 500 µL מהדגימה עם 500 µL של guanidine thiocyanate בריכוז 6 M בתוך מבחנה של 1.5 mL. לאחר מכן, לחצו על נורת השאיבה של פיפטת ההפקה כדי להוציא את האוויר. שאבו את כל נפח הדגימה (1 mL) אל תוך פיפטת ההפקה מעל החומר הסופג על ידי שחרור איטי של נורת השאיבה.

הפוך את כלי המיצוי כך שחרוזי הסופח והדגימה יזלגו אל תוך הנורה. גרס את חרוזי הסופח יחד עם הדגימה בתוך הנורה, תוך הקפדה לא להוציא את הדגימה מחוץ לפיפט המיצוי.

הפכו את פיפטת החילוץ, והשליכו את הדגימה חזרה אל תוך המבחנה המקורית בנפח 1.5 מיליליטר. שאבו את כל הדגימה בנפח מיליליטר אחד אל תוך פיפטת החילוץ, תוך מעבר על הסורבנט בקצב בינוני. תוך הקפדה להשאיר את הסורבנט בצוואר פיפטת החילוץ, השליכו את כל הדגימה אל תוך המבחנה בנפח 1.5 מיליליטר על ידי לחיצה על הפחה.

חזור על תהליך זה, והעבר את הדגימה מעל הסורבנט ארבע פעמים נוספות, לסך הכל חמישה מעברים. לאחר המעבר החמישי מעל הסורבנט, רוקן את כל דגימת ה-1 milliliter לתוך 4 milliliter של בופר חילוץ חלבונים בתוך מבחנה קונית של 15 milliliter. ערבב את המבחנה על ידי הפיכה, ולאחר מכן סגור את המבחנה והשאר אותה בצד לשימוש מאוחר יותר.

שטפו את החומצות הגרעיניות המבודדות על ידי העברת מיליליטר אחד של 95%ethanol על הסופח שלוש פעמים, תוך החזרת ה-ethanol למבחנה המקורית. לאחר המעבר האחרון, חזרו על השטיפה שלוש פעמים נוספות באמצעות מיליליטר שני של 95%ethanol לשטיפה. השלב הבא בפרוצדורה הוא ייבוש הסופח; שחזור החומצות הגרעיניות מהסופח מתבצע בצורה מיטבית כאשר הסופח יבש.

אני יודע ששלב זה הוא מייגע. עם זאת, אם תשלים שלב זה במסגרת הזמן המומלצת, תוצאותיך יהיו טובות יותר. לחץ ושחרר את הפומפית במשך חמש דקות.

העבירו אוויר סביבתי דרך פיפטת המיצוי כדי לייבש את חומצות הגרעין ואת שכבת הסופח, ונגבו שאריות אתנול מקצה פיפטת המיצוי. באמצעות נייר Kim wipe, השחילו חזרה את חומצות הגרעין על ידי העברה של 250 µL של TRIS בריכוז 10 mM על פני הסופח חמש פעמים. ניתן להחליף את בופר ה-TRIS בכל תמיסה מימית מתאימה אחרת, כגון PBS.

התמיסה המתקבלת מכילה את החומצות הגרעיניות המופרשות. כדי לבצע תחילה הפקת חלבונים, ערבב את הדגימה בבפר חילוץ חלבונים שהופרש מראש על ידי היפוך השפופרת. העבר בפיפטה כ-2 עד 3 מיליליטר מתוך דגימה זו בת נפח 5 מיליליטר על פני הסורבנט של פיפטת חילוץ חדשה. רוקן את כל הדגימה אל תוך אותה שפופרת קונית בנפח 15 מיליליטר, תוך הקפדה לשמור על הסורבנט בצווארה של פיפטת החילוץ.

חזור על תהליך זה. העבר את הדגימה על הסורבנט 15 פעמים. שטוף את הסורבנט ואת החלבון הקשור על ידי העברת מיליליטר אחד של 95%Ethanol מעל מיטת הסורבנט שלוש פעמים, תוך ריקון האתנול אל תוך המבחנה המקורית; שטוף שלוש פעמים נוספות באמצעות מיליליטר שני של 95%ethanol.

השלב הבא בפרוצדורה הוא ייבוש הסורבנט שוב. בדומה לחומצות גרעיניות, השחזור של חלבונים מתבצע בצורה מיטבית כאשר הסורבנט מיובש למשך פרק זמן ממושך יותר.

לחץ ושחרר את הפפיפטה במשך חמש דקות, כדי להעביר אוויר סביבתי דרך פיפטת ההוצאה. כדי לייבש את מצע סורבנט החלבון, נגב את שאריות האתנול מקצה פיפטת ההוצאה. בעזרת נייר Kim wipe, השג את החלבון על ידי העברת 250 microliters של PBS על הסורבנט חמש פעמים.

ניתן להחליף את תחליל ה-PBS בכל תמיסה מימית מתאימה אחרת, כגון tris בריכוז 10 millimolar, pH 6.8. התמיסה המתקבלת מכילה את תכולת החלבון של הדגימה. הגנים של רעלן השיגה (shiga toxin) הקשורים לשבט E DL 9 33 של entero hemorrhagic e coli oh 1 5 7 H seven הועשרו מתוך הליך הפקת חלבוני חומצות גרעין באמצעות פיפטת הפקה.

הגנים של רעלן השיגה (shiga toxin), רעלן שיגה 1 ורעלן שיגה 2, נמצאים על פאגים חיידקיים מיתונים דמויי למבדה (lambda) ועל פאגים חיידקיים פגומים תחת בקרתו של הקידום PR. הפעלת תגובת ה-SOS ב-e coli מובילה לאינדוקציה של פרו-פאג (pro phage) ו/או לייצור רעלן. במקרה זה, קיימת עלייה משמעותית בהגברה של הגן של רעלן שיגה 2 כאשר תגובת ה-SOS מושרית על ידי mitomycin C בהשוואה לבקרת הביקורת שלא טופלה.

דבר זה מרמז על אינדוקציה של פרו-פאג'ים (prophages) ושכפול גנום הפאג'. החלבון שהופק מניסויי בידוד חלבון וחומצות גרעין המתוארים בסרטון הוא אימונו-ריאקטיבי. פראקציית החלבון המבודדת הועברה לפסי בדיקה מסוג lateral flow assay למשם זיהוי מהיר של e coli O 1 57.

הבקרות מראות זיהוי חיובי בכל הדגימות הנושאות את e coli oh 1 5 7 עם או ללא השראת shiga toin, כפי שנראה בנוכחותן של שני פסים אדומים. הנתונים מראות גם תוצאות חיוביות עבור אותן דגימות הנושאות את e coli oh 1 5 7 שעובדו להוצאת חומצות גרעין וחלבון באמצעות פיפטת המיצוי. נתונים אלו מראים כי החלבון שבודד מכל דגימה הוא אימונו-אקטיבי, ובכך הוא מעורר תגובה חיובית.

החלבון המבודד מתאים לאלקטרופורזה, כפי שמוצג כאן בג'ל 8%Acrylamide שצבעו ב-kumasi ובו BSA שבודד מ-six molar gudina isothiocyanate. באמצעות שיטת המיצוי, הפיפט והפרוטוקול הנלווה, ניידות האלקטרופורזה של החלבון המבודד זהה לזו של דגימות הביקורת. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך פחות מ-20 דקות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגייעו להבנה ברורה של האופן שבו ניתן לבודד חלבונים וחומצות גרעיניות מהמכשיר הפשוט. תודה שהקדשתם מזמנכם לצפייה בסרטון שלנו.