ניתוח ובניית מבני חומצות גרעין עם 3DNA

המטרה הכללית של הליך זה היא להנגיש את חבילת התוכנות 3D NA למדעני מעבדה ולאחרים, כדי לחקור את הארגון המרחבי של DNA ו-RNA באמצעות כלים חישוביים מתקדמים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הורדת התוכנה מפורום 3D NA והתקנתה במחשב מקומי. השלב השני הוא ניתוח של מבנה DNA מייצג ברמת שלבי זוגות הבסיסים המרכיבים אותו.

בשלב הבא, מבנה ה-DNA העצמו עובר שינוי ברמת הצעד של זוג הבסיסים, ולאחר מכן נבנה מחדש באמצעות הפרמטרים שהוגדרו מחדש לצעד זוג הבסיסים. השלב הבא הוא ניתוח של מאסף גדול של מבנים קשורים. השלב הסופי הוא יישור של קבוצת מבני DNA קשורים על גבי מסגרת ייחוס משותפת, במטרה להמחיש עיוותים גלובליים של המבנים.

בסופו של דבר, כלי ה-3D NA משמשים לבחינה כיצד שלבי זוגות בסיסים בודדים, כולל אלו הקשורים לתרופות ולחלבונים, תורמים לקיפול הכללי של ה-DNA, ולזיהוי האתרים והכיוונים של עיוותים גלובליים משמעותיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהתוכנה היא חסונה וניתנת ליישום רחב על מגוון מבנים שונים המכילים חומצות גרעין. השיטה יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביוכימיה ובביופיזיקה, כגון כיצד מאורגנים גנומים בתלת-ממד, ואיזה סוג של דפורמציה יכול לאמץ ה-DNA.

כדי להתחיל בהתקנת חבילת התוכנה, התחברו לאתר three DA בכתובת xthreed. org ולחצו על הקישור לפורום 3D NA. בתוך הפורום, בחרו בקישור להרשמה (register) ועקבו אחר ההוראות ליצירת חשבון חדש.

לאחר הגדרת שם משתמש וסיסמה, היכנסו לפורום, בחרו בקישור ההורדות (downloads) במדור הברכה, ובדף החדש שייפתח, בחרו ב-3D NA download. לחצו פעמיים על קובץ ה-tar gz כדי ליצור תיקייה בשם X 3D NA dash V 2.1, המכילה את התוכנה 3D NA. פתחו את אפליקציית הטרמינל, הנמצאת בדרך כלל תחת utilities במחשבי Macintosh, ועברו לספריה X 3D NA dash V 2.1.

הריצו את סקריפט ההגדרה הדרוש כדי ש-3D NA יפעל כראוי. ניתן למצוא את כל הפקודות המשמשות בסרטון זה בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, העתיקו את הגדרות הייצוא בנות השתי שורות המופיעות על המסך.

אם המשתמש מיקם את התוכנה בספריית האפליקציות, שתי השורות צריכות להופיע כפי שמוצג כאן. פתחו את אפליקציית עורך הטקסט הנמצאת בספריית האפליקציות. בתפריט העיצוב, בחרו באפשרות "הפוך לטקסט פשוט".

אם קיים קובץ BRC, פתחו את הקובץ כטקסט, ערכו אותו והדביקו את הגדרות הייצוא בסוף הקובץ. אם לא קיים קובץ bash RC, הדביקו את הגדרות הייצוא לקובץ ריק ושמרו אותו בשם bash RC בספריית הבית. כדי שההגדרות החדשות יהיו זמינות, הפעילו את קובץ ה-Bash RC שנשמר לאחרונה בתוך תוכנית הטרמינל.

סרטון זה מדגים את הניתוח של מבנה חומצה גרעינית מייצג, ה-DNA הקשור לחלבון HBB מהחיידק Borrelia bergdorfii. השלב הראשון בניתוח תלת-ממדי של חומצות גרעיניות הוא יצירת קובץ המרכז את כל הבסיסים הזיווגיים. פעולה זו מתבצעת על ידי הקלדת פקודה להפעלת תוכנית Find para על המבנה האטומי השמור בקובץ NP2MP2.pdb.

השלב הבא בניתוח הוא קביעת הפרמטרים הגאומטריים המאפיינים את המבנה. הפקודה analyze מקבלת כקלט את קובץ זוגות הבסיסים ויוצרת מספר קובצי פלט המופיעים בספריית העבודה. לאחר מכן, ניתן לחשב את הערכים הגאומטריים על ידי הקלדת analyze two MP two bps.

קבצי הפלט הנוצרים כוללים את mp2out, המכיל סקירה כללית של הפרמטרים שחושבו, ואת bpco_steppar, המכיל רשימה של פרמטרי הגוף הקשיח (rigid body parameters). בנוסף לניתוח מבנה של חומצה גרעינית, תוכנת 3D NA מספקת את היכולת לבנות מודל מבני מתוך פרמטרי גוף קשיח באמצעות פקודת rebuild, וזאת כדי ליצור מודל אטומי מקורב הכולל קואורדינטות הן עבור השלד (backbone) והן עבור אטומי הבסיס. הקלידו את הפקודה המופיעה בטקסט. פקודה זו מנחה את 3D NA להכניס קונפורמציה סטנדרטית של שלד BDNA בבניית מודלים מתוך פרמטרי גוף קשיח.

ניתן להקים מודל סליל כפול עם פרמטרי הגוף הקשיח שנמצאו במבנה ה-H-B-B-D-N-A על ידי הקלדת הפקודה המתאימה. ניתן לערוך את קובץ ה-par של שלב ה-bpco כדי ליצור מבנה שונה. במקרה זה, זוויות ה-roll הקיצוניות שנוצרו בשני האתרים בעלי הכיפוף המקסימלי שונו.

לאחר מכן, המבנה נבנה כאשר קובץ הקלט הוא קבוצת פרמטרי השלבים המעודכנת. ניתן לצפות בשני המודלים באמצעות תוכנת צפייה מולקולרית סטנדרטית, בניגוד לניתוח של מבנה בודד המכיל חומצת גרעין. חלק זה של הסרטון יראה כיצד לנתח מקבץ גדול של מבנים בקבוצת קבצים, המתחילים בשם MD_set1.pdb ומסתיימים במספר.

השלב הראשון בניתוח הוא זיהוי הבסיסים הצומדים על ידי הרצת תוכנית ה-find pair כפי שבוצע קודם לכן; מכיוון שכל קבוצת המבנים חולקת את אותה תכנית הצמדת בסיסים, יש להריץ את find pair פעם אחת על קובץ מייצג, במקרה זה הקובץ המסתיים ב-1001. פעולה זו מייצרת את המידע על הצמדת הבסיסים ושומרת אותו בקובץ MD at set one BPS PS. השלב הבא מוצא את הפרמטרים הגיאומטריים של כל קבוצת המבנים באמצעות הפקודה X 3D ncore ensemble.Analyze. לאחר מכן ניתן לחלץ את פרמטרי הגוף הקשיח הרצויים מקובץ פלט הסקירה הכללית MD at set one out.

פעולה זו מבוצעת באמצעות תמצית ה-Command X three DCO ensemble. זוויות הגלילה (roll angles) מופקות, ונוצר קובץ טקסט המכיל את זוויות הגלילה מופרדות בפסיקים. קובץ זה ניתן לקריאה בתוכנות אחרות לצורך ניתוח והצגה גרפית נוספים.

הגרסה העדכנית ביותר של 3D NA כוללת תכונה חדשה המאפשרת למשתמש לבחון מספר מבנים מנקודת מבט משותפת. פקודת reorient של X three DCO ensemble מחפפה אוסף של מבנים קשורים על בסיס זוג בסיסים או שלב של זוג בסיסים משותף, כפי שנעשה בפרוטוקולים קודמים. השלב הראשון הוא חישוב צימוד הבסיסים של ה-DNA באמצעות תוכנת find pair.

במקרה זה, קובץ הקלט הוא שני קובצי PDB המכילים 10 מבנים של ה-CIA coli, כאשר האופרטור O 3D NA קשור לחלק הראש (headpiece) של חלבון ה-LAC Repressor. הפקודה X three DCO ensemble reorient תיישר את המודלים הבודדים במבנה רב-מודלי על גבי מערכת ייחוס משותפת. פקודה זו דורשת הן את קובץ ה-PDB והן את קובץ זיווג הבסיסים מהשלב הקודם כקלט.

בפקודה כלולה גם זהות שלב זוג הבסיסים שאליו מיושרים כל המבנים. ממשק האינטרנט של W 3D NA כולל כמה מהתכונות הפופולריות של חבילת התוכנה 3D NA. חלק זה של הסרטון מפנה את תשומת הלב ליכולת לבנות באמצעות שרת האינטרנט מודלים תלת-ממדיים של DNA מעוטר בחלבונים.

השלב הראשון בבניית מודל DNA מקושט בחלבון הוא ביקור באתר W 3D NA הממוקם בכתובת W three d.rutgers.edu. בחירה באפשרות reconstruction מהתפריט בפינה השמאלית העליונה של הדף תפעיל את יכולות בניית המודל המקוונות. השלב הבא הוא ללחוץ על קישור bound protein DNA template שנמצא בתוך התיבה המוצטצלת במרכז הדף החדש.

בחירה זו תפעיל תפריט נפתח, המאפשר למשתמש להגדיר את מספר החלבונים הקשורים. בחירת מספר החלבונים הקשורים תוביל לדף הגדרות חדש. לאחר מכן, המשתמש יוכל להקליד או להדביק את הרצף הרצוי.

בתיבת הטקסט, במרכז הדף החדש, מופיע תפריט נפתח מתחת לתיבת הטקסט לבחירת הקונפורמציה הספירלית של אזורי ה-DNA שאינם קשורים. בתחתית דף המפרטים קיימת תיבת טקסט להזנת מיקומי הקשירה ושמות הקבצים של החלבונים הקשורים. מיקום הקשירה מגדיר את מיקומו של מרכז מקטע החלבון הקשור על רצף ה-DNA.

בתחתית דף המפרט, קיימת תיבת סימון המאפשרת למשתמש להפיק תצוגה מקדימה של ה-DNA הקשור לחלבון. במקרה זה, תיבה זו מסומנת וכפתור ההמשך נלחץ. פעולה זו מפיקה דף סקירה המפרט את הפרמטרים שנבחרו, כמו גם כל שגיאה שעשויה הייתה להיווצר כתוצאה מחפיפה בין אתרי הקשירה שנבחרו.

המשתמש יכול לבחור בכפתור "חזור" (back) במידה ויש לבצע שינויים, או בכפתור "בנה" (build) כדי להמשיך. הדף הבא מציג תמונה סטטית של קומפלקס ה-DNA-protein בסידור המורחב ביותר שלו ומאפשר ויזואליזציה אינטראקטיבית מקוונת באמצעות הרשת. המשתמש יכול גם להוריד קובץ המכיל קואורדינטות אטומיות.

כלי התוכנה 3D NA משמשים באופן שגרתי לניתוח מבני חומצות גרעין. ערכי הפרמטרים של הגוף הקשיח חושפים עיוותים במבנה התלת-ממדי, כגון שני אתרים של כיפוף קיצוני של DNA אל תוך החריץ הגדול (major groove) עם זוויות roll חיוביות גדולות שנמצאו בשלבים 13 ו-22. במתחמי הגביש של DNA עם חלבון RHBB של Borrelia Bergdorf.

היכולת של התוכנה לשחזר מבנים מהכמויות הללו מאפשרת לקבוע כיצד בסיסים בודדים ושלבים של זוגות בסיסים תורמים לקיפול המולקולרי הכולל. כפי שמוצג כאן, הכפיפה הגלובלית של ה-DNA המושרה על ידי HBB משקפת יותר מאשר את שתי עיוטי התפקיד הקיצוניים שצוינו לעיל. ה-DNA נותר מעוקל מאוד כאשר הוא משוחזר עם שלבי זוגות בסיסים אלו במצב ישר.

זהו המצב שבו שני הערכים הגבוהים ביותר של התפקיד הוגדרו כשיעור אפס. היכולת החדשה ב-3D NA לבחון מספר רב של מבנים קשורים מאפשרת לחלץ דפוסים התלויים הן ברצף והן בזמן בסידורים המרחביים של מולקולות DNA ו-RNA מסומולציה. לדוגמה, ציפוי בצבע צהוב של זוויות הגלגול בין זוגות בסיסים עוקבים בשתי קבוצות גדולות של מבני DNA מסומולציה חושף כיפוף מועדף של מולקולות אלו בשלבי זוגות בסיסי פורין ב-Permian.

ערכי ה-roll הגבוהים יותר המוצגים בצבע אדום, אשר נשמרים לפרקי זמן קצרים בקצוות ה-DNA, מרמזים על המסה מקומית והתגבשות מחדש של מבנה הסליל הכפול. דפוסי השונות של פרמטרים אחרים של גוף קשיח, כגון הזוויות והמרחקים בין בסיסים משלימים, יכולים לסייע בפענוח העיוותים המבניים המדויקים. היכולת של תוכנת 3D NA להכווין מחדש מולקולות קשורות במסגרת ייחוס משותפת חושפת מאפיינים של המבנה הכללי החבויים ברבים מהקבצים המאוחסנים במאגר נתוני החלבונים (protein data bank).

לדוגמה, יישור קונבנציונלי של מבנים קשורים על בסיס התאמה של שורש ממוצע ריבועי (root mean square fit) של אטומים מקבילים מניב סדרה של מסלולים מרחביים דומים שחופפים בקירוב זה את זה; כאן, 10 המודלים המבוססים על NMR של המפעיל O 3D NA של Escherichia coli הקשור לחלקי הראש של חלבון ה-LAC repressor, סמיכות של אותם מבנים על מערכת צירים משותפת בבסיס הזוג הקציי ב-5' של כל דופלקס, חושפת עיוותים משמעותיים במבנה הגלובלי שבהם המולקולות גמישות בכיוונים שונים במידה ניכרת. השונות המבנית עשויה להשפיע על הקלות שבה חלבון ה-LAC repressor של Escherichia coli נקשר ל-O three ומשרה לולאה בין O three למפעילים רחוקים רצפית באופראון ה-LAC. כפי שמוצג כאן, מיקום מדויק של חלבון ארכיטקטוני כגון HBB מ-Borrelia burgdorferi יכול להשפיע באופן דרמטי על הקיפול הכולל של ה-DNA.

אם שני עותקים של המבנה המוכר ברזולוציה גבוהה מופרדים על ידי 43 זוגות בסיסים, פרגמנט DNA של 81 זוגות בסיסים נסגר לתצורה הדוקה, כמעט מעגלית. אם שני החלבונים מופרדים על ידי חמישה זוגות בסיסים נוספים, ה-DNA עוקב אחר נתיב פתוח ומפותל. הסידורים השונים מאוד של הדופלקס המעוטר בחלבונים מדגימים כיצד המרווח בין חלבונים ארכיטקטוניים יכול להשפיע על הקיפול למעגל או ליצירת לולאות של DNA לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה המבנית של חומצות גרעיניות לחקור אינטראקציות בין DNA לחלבונים, RNA, קיפול ועיצוב ננו-חלקיקים, במטרה להשיג הבנה טובה יותר של פגמים התפתחותיים ומחלות כגון סרטן ולעצב תרפיה חדשה.