מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

המטרה הכללית של הליך זה היא למעקב אחר תאים שעברו המרה פוטו-כימית בעובר דג זברה חי. הדבר מושג תחילה על ידי הטמעה של עובר, המבטא חלבון פלורסצנטי פוטו-המירי ספציפי לרקמה, באגרוז בעל טמפרטורת התכה נמוכה. לאחר מכן, החלבון בתוך אזור העניין עובר המרה פוטו-כימית מלאה.

לאחר מכן מוציאים בזהירות אתו העובר מה-aros ושומרים אותו במי ביצים בטמפרטורה של 28.5 °C עד לשלבים מאוחרים יותר. לבסוף, העובר שעבר המרה פוטו-כימית מוטמע שוב ב-aros בעל טמפרטורת התכה נמוכה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי ניתן לזהות במדויק תאים שעברו המרה פוטו-כימית בשלבים מאוחרים יותר, הודות לנוכחות היציבה של החלבון שהומר פוטו-כימית, באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

אנו סבורים כי השיטה שנציג היום תהיה יעילה מאוד בהקשר של ביולוגיה של התא וביולוגיה התפתחותית. לכן, אנו מאמינים ששימוש במתודולוגיה זו בהקשר של נדידת תאים, דינמיקה של רקמות והתנהגויות תאיות אחרות יהיה מועיל מאוד. את הפרוצדורה תדגים ורוניקה לומבארדו, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי, לאחר הכלאה של דגי זברה טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בעל יכולת המרה פוטו-כימית.

יש לבחור את העוברים הזוהרים ביותר שהם הומוזיגוטים ולגדל אותם בטמפרטורה של 28.5 °C עד שיגיעו לשלב הרצוי. השתמשו בפינצטה כדי להסיר מהם את מעטפת הביצה (dec oate) בתוך כלי זכוכית עם מי ביצים להרדמת העוברים. השתמשו בפיפטת זכוכית או בקצה פיפטה חתוך כדי להעביר אותם אחד אחד לתוך trica.

העבירו עובר שהורדם אל מכסה של צלח תרבית ושמרו את העובר בתוך הנפח הקטן ביותר האפשרי של מדיום. העבירו את העובר לתוך agros על ידי פיפטינג עם 1% low melting temperature agros עם trica בטמפרטורה של 30 °C, והניחו אותו בתוך צלח תרבית בעל תחתית של זכוכית כיסוי. השתמשו בטיפ פלסטיק חלק כדי לכוון את העובר לאחר שה-agros התמצמץ (polymerized).

כסו זאת בתמיסת Trica תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך המצויד במקור לייזר של 405, 488 ו-561 ננומטר ובעדשה אובייקטיבית של 20x. השתמשו בלייזרים של 488 ו-561 ננומטר כדי להפיק Z stack של כל מבנה הדגימה, כולל אזור העניין. בחרו בכלי סדרת הזמנים והגדירו שני מחזורים ללא מרווח, אחד לפני ואחד אחרי המרת הפוטו.

בחר את כלי האזור והגדר אזור עניין אחד או יותר להמרה פוטוغرافית. לאחר מכן, בחר את כלי ההלבנה (bleaching) והגדר תחילת הלבנה לאחר סריקה. אחד משני הלייזרים המשמשים כאן הוא לייזר דיודה של 30 milliwatt באורך גל של 405 nanometer.

בצעו אופטימיזציה קפדנית כדי להשתמש בכמות המינימלית של אור לייזר הדרושה להמרה פוטוכימית מלאה, זאת על ידי שינוי עוצמת אור הלייזר, מספר חזרות הסריקה של אזור העניין ומהירות הסריקה. סרקו את הדגימה באמצעות לייזרים של 488 ננומטר ו-561 ננומטר כדי להמחיש את שאריות הפלואורסצנציה הירוקה ואת הפלואורסצנציה האדומה שהומרה פוטוכימית של החלבון הפלואורסצנטי הניתן להמרה. לאחר ההמרה הפוטוכימית, השליכו את התמיסה ובעזרת מחט או קצה פלסטיק חלק הוציאו בזהירות את העובר מהאגרוס.

שמר את העובר במי ביצים בחושך בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius עד לשלב ההתפתחות הרצוי. טמיע את העובר פעם שנייה, ולאחר מכן צור Zack של הדגימה, כולל את אזור העניין, שוב באמצעות לייזרים של 488 ו-561 nanometer. מכיוון שפרוטוקול זה אינו משפיע על ההתפתחות הנורמלית, ניתן להבחין בעובר שעבר פוטו-המרה בשלבים מאוחרים יותר.

להלן דוגמה לבדיקת המרה פוטוכימית. תאי אנדותל נמעמדו במהלך התפתחות דגי זבוב מ-48 עד 72 שעות לאחר ההפריה, באמצעות קו דגי דגם טרנסגני המבטא kick G בתוך גרעיני האנדותל, כפי שמוצג כאן. לפני ההמרה הפוטוכימית, kick G בוטה ברקמה האנדותליאלית וניתן היה לזהותה רק כפלואורסצנציה ירוקה באמצעות לייזר ארגון של 488 ננומטר. סריקות בקרה עם לייזר של 561 ננומטר לפלואורסצנציה אדומה לא זיהו kick GR שהומר פוטוכימית לפני ביצוע ההמרה.

לאחר מכן, האזור המבוקש עבר המרה פוטוכימית מלאה באמצעות לייזר דיודה בנצילות של 405 nanometer בעוצמה של 10%, למשך 20 חזרות, וכלי הדם בראש נסרקו שוב באמצעות לייזרים בנצילות של 488 nanometer ו-561 nanometer. בלוח זה, ה-green kick G עבר כולו לצבע אדום בתוך האזור המבוקש, כדי לעקוב אחר התאים האנדותליאליים שעברו המרה פוטוכימית בשלבים מאוחרים יותר. העובר נצפה 24 שעות לאחר ההמרה הפוטוכימית, שהן כ-72 שעות לאחר ההפריה, בתוך רקמות אנדותליאליות שמקורן באזור המבוקש שעבר המרה פוטוכימית.

נצפו both חלבוני kick G שאינם מומרים ואלו שהומרו באופן פוטו-כימי, וזאת בשל היציבות של kick G המומר פוטו-כימית שפולט פלואורסצנציה אדומה, ובשל סינתזה של kick G ירוק חדש שאינו מומר לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לחקור ביולוגיה של התא ושחזור רקמות במספר מיני דגים.